CRISPR) hija teknika ta' editjar tal-ġenoma tat-tielet ġenerazzjoni: CRISPR irrivoluzzjonat id-dinja

Ir-ripetizzjonijiet palindromiċi qosra miġbura b'mod regolari u interspazjati (CRISPR) hija teknika ta' editjar tal-ġenoma tat-tielet ġenerazzjoni li rivoluzzjonat id-dinja bir-riżultati ta' throughput għoli tagħha. Intużat biex tikkura diversi mard u infezzjonijiet bijoloġiċi. Diversi batterji u prokarjoti oħra (bħall-arkaea) għandhom ukoll sistemi CRISPR/Cas9 biex jiddefendu kontra l-faġi. Ġie rrappurtat li strateġiji bbażati fuq CRISPR/Cas9 jistgħu jinibixxu t-tkabbir u l-progressjoni tal-kanċer tas-sider triplu negattiv (TNBC) billi jimmiraw lejn ġeni ta' reżistenza potenzjalment mibdula, traskrizzjoni, u regolazzjoni epiġenetika. Dawn l-interventi terapewtiċi jistgħu jgħinu biex jindirizzaw problemi ta' sfida bħar-reżistenza għall-mediċini osservata anke fit-TNBC. Bħalissa, diversi metodi jintużaw biex CRISPR/Cas9 jitwassal liċ-ċelloli fil-mira, bħal metodi fiżiċi (mikroinjezzjoni, elettroporazzjoni u modi idrodinamiċi), virali (virus assoċjat mal-adeno u lentivirus) u mhux virali (liposomi u nanopartiċelli tal-lipidi). )-partiċelli). Għalkemm ġew żviluppati diversi mudelli biex jistudjaw il-kawżi molekulari tat-TNBC, in-nuqqas ta' metodi sensittivi u mmirati biex jitwasslu għodod ta' editjar tal-ġenoma in vivo jillimita l-applikazzjoni klinika tagħhom. Fil-qosor, din ir-reviżjoni teżamina b'mod komprensiv il-progress, l-isfidi, il-limitazzjonijiet u l-prospetti tat-trattament CRISPR/Cas9 għat-TNBC abbażi tal-evidenza eżistenti. Nenfasizzaw ukoll kif il-kombinazzjoni tal-intelliġenza artifiċjali u t-tagħlim awtomatiku tista' ttejjeb l-istrateġiji CRISPR/Cas9 fit-trattament tat-TNBC.
Il-kanċer huwa kkaratterizzat minn diviżjoni taċ-ċelluli mhux ikkontrollata, tfixkil tal-punti ta' kontroll taċ-ċiklu taċ-ċelluli, u mutazzjonijiet fil-ġeni li jrażżnu t-tumuri (TSGs) (Matthews et al., 2022). Fost it-tipi differenti ta' kanċer, il-kanċer tas-sider huwa l-aktar tip komuni ta' kanċer fin-nisa u għandu rata ta' mortalità għolja madwar id-dinja (Waks and Winer, 2019). Il-kanċer tas-sider huwa marda eteroġenja b'karatteristiċi diversi, bħal karatteristiċi istoloġiċi u bijoloġiċi, preżentazzjoni u mġiba klinika, u rispons għat-trattament (Weigelt et al., 2010). Il-klassifikazzjoni tal-kanċer tas-sider tipprovdi għarfien preċiż għad-dijanjosi tal-kanċer tas-sider u l-pronjosi tat-tumur. L-użu ta' bijomarkaturi komuni u karatteristiċi klinikopatoloġiċi kien il-kriterju ewlieni għall-klassifikazzjoni tal-kanċer tas-sider (Tsang and Tse, 2019). Il-pronjosi u r-rispons għat-trattament tal-kanċer tas-sider huma influwenzati minn bosta fatturi, inkluż il-preżenza tar-riċettur tal-estroġenu (ER), ir-riċettur tal-proġesteron (PR), ir-riċettur 2 tal-fattur tat-tkabbir epidermali uman (HER2/neu), u l-grad istoloġiku, it-tip ta' tumur, u l-grad. daqs u metastasi fil-limfonodi (Al-Tubaiti, 2020). Ġew identifikati ħames sottotipi molekulari intrinsiċi ta' kanċer tas-sider, inklużi luminali A, luminali B, arrikkit bl-HER2, bażali, u baxx fil-claudin (Prat et al., 2015). It-TNBC huwa sottotip molekulari ta' kanċer li ma jesprimix l-ER, PR, u HER2 kollha (Yin et al., 2020). Dawn il-karatteristiċi patoloġiċi huma assoċjati mat-TNBC, u jikkonfermaw il-progressjoni rapida tiegħu u n-natura aktar aggressiva minn kwalunkwe tip ieħor ta' kanċer tas-sider (Feng et al., 2018). Barra minn hekk, Peru et al (2000) użaw it-teknoloġija tal-mikroarray biex jikklassifikaw mill-ġdid il-kanċer tas-sider u jidentifikaw ħames sottotipi intrinsiċi ta' kanċer tas-sider (Cadenas, 2012). Il-kanċer tas-sider bażali huwa sottotip ta' kanċer tas-sider li għandu fenotip triplu negattiv u huwa assoċjat ma' progressjoni rapida. Ta' min jinnota li l-kanċers tas-sider kollha li jixbħu l-kanċer bażali huma komunement dijanjostikati ħażin bħala TNBC, iżda 77% biss huma TNBC; B'kuntrast, 71–91% tat-TNBC huma simili għall-kanċer bażali, li jindika li dawn iż-żewġ tipi ta' kanċer tas-sider jikkoinċidu u jirrappreżentaw klassifikazzjonijiet differenti (Wang D.-Y. et al., 2019). Dan joħloq il-ħtieġa li tiġi kkaratterizzata l-eteroġeneità tat-TNBC biex tiġi ċċarata l-pronjosi u jiġu identifikati risposti potenzjali għal trattamenti attwali u futuri. Barra minn hekk, it-TNBC jammonta għal 15–20% tal-każijiet kollha ta' kanċer tas-sider u huwa aktar komuni fin-nisa taħt il-50 sena. Mutazzjonijiet BRCA1 jew BRCA2 ġew irrappurtati f'madwar 20% tal-każijiet ta' TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Studji wrew ukoll li t-TNBC għandu mikroambjent immuni distint li jinkludi livelli għoljin ta’ fatturi tat-tkabbir endoteljali vaskulari, makrofaġi assoċjati mat-tumur (TAMs), limfoċiti li jinfiltraw it-tumur (TILs), u molekuli oħra involuti fit-tkabbir u l-migrazzjoni tat-tumur. Għalhekk, il-fehim tal-mikroambjent tat-TNBC huwa kritiku għall-pronjosi u t-trattament tiegħu (Fan and He, 2022).
Biex tiġi vvalutata l-pronjosi tat-TNBC u jiġi żgurat trattament effettiv, hija importanti dijanjosi preċiża, ibbażata prinċipalment fuq l-immunoistokimika (IHC) biex jinstabu ER, PR u HER2, u mammografija biex jinstabu neoplażmi tas-sider. Madankollu, il-mammografija ma tistax turi b'mod adegwat karatteristiċi intratumorali bħal nekrożi u fibrożi (Deepak Singh et al., 2021). Peress li pronjosi u dijanjosi ħżiena jipprevjenu lit-tobba milli jippreskrivu l-mediċini t-tajba (Chaudhary, 2020), jintużaw diversi strateġiji biex titjieb il-kura għall-pazjenti bit-TNBC. Bħalissa, żewġ mediċini, doxorubicin u cyclophosphamide, jintużaw f'pazjenti bit-TNBC u wrew riżultati tajbin. Barra minn hekk, jintużaw mediċini oħra tal-platinu, bħal carboplatin u cisplatin (Sikov et al., 2015). Barra minn hekk, inibituri PARP bħal Olaparib, Velaparib, u PF-01367338 intużaw bħala mediċini potenzjali ta' kimoterapija għat-trattament tat-TNBC (Ishino et al., 2018). Peress li ġie rrappurtat li l-mogħdijiet tas-sinjalar Wnt/b-Catenin, NOTCH, u Hedgehog huma involuti fl-okkorrenza u l-progressjoni tat-TNBC, l-immirar tal-mediċini lejn dawn il-mogħdijiet jista' jkun strateġija importanti (Aysola et al., 2013). Għalkemm il-kirurġija, ir-radjuterapija u l-kimoterapija jibqgħu l-bażi tat-trattament għat-TNBC illum, sar progress sinifikanti fl-iżvilupp ta' trattamenti ġodda inkluż terapija mmirata, immunoterapija, diversi għodod ta' editjar tal-ġeni relatati mas-CRISPR bħal Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, editjar ewlieni, u terapija tal-ġeni mmirata lejn CRISPR/Cas9. Hawnhekk se niffukaw fuq diversi għodod ta' editjar tal-ġeni relatati mas-CRISPR użati fit-trattament tat-TNBC. Fost dawn, CRISPR/Cas9 irċieva attenzjoni mifruxa.
Cas9n, magħruf ukoll bħala Cas9 nickase, huwa varjant ġenetikament inġinerizzat tal-proteina Cas9 derivata mis-sistema ta' editjar tal-ġenoma CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Fil-forma oriġinali tagħha, il-proteina Cas9 fiha żewġ dominji nukleażi: RuvC u HNH, li l-funzjoni ewlenija tagħhom hija l-qsim taż-żewġ linji tad-DNA. Madankollu, f'Cas9n, wieħed mid-dominji nukleażi, HNH, jiġi mutat ġenetikament u jsir inattiv. Għalhekk, id-dominju HNH ta' Cas9n jibqa' mhux funzjonali. Id-dominju RuvC biss jibqa' attiv, li jippermetti lil Cas9n jaqta' jew joħloq ksur fuq linji singoli tad-DNA (Trevino u Zhang, 2014). Meta mqabbel ma' Cas9, Cas9n jista' jnaqqas b'mod effettiv l-effetti barra mill-mira u jtejjeb b'mod preċiż il-mekkaniżmi tat-tiswija taċ-ċelloli. Cas9n jista' jintuża biex isolvi diversi problemi, bħall-ħolqien ta' ksur f'postijiet speċifiċi fid-DNA b'żewġ linji. Għal dan il-għan, żewġ molekuli Cas9n ġew ikkombinati u użati flimkien (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) hija proteina kinase attivata minn mitogen li sservi bħala regolatur ewlieni waqt il-metastasi tat-TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 jista' jattiva diversi mogħdijiet ta' sinjalazzjoni li jwasslu għal metastasi tat-TNBC. Pereżempju, il-mogħdija c-Jun N-terminal kinase (JNK) tirregola l-motilità taċ-ċelluli u d-degradazzjoni tal-matriċi extraċellulari, u MLK3 jattiva l-mogħdija JNK, u b'hekk itejjeb il-motilità taċ-ċelluli u jagħti proprjetajiet invażivi (Rattanasinchai u Gallo, 2016). MLK3 jirregola wkoll l-EMT. Biex jagħmel dan, jattiva fatturi ta' traskrizzjoni downstream bħal Snail, Slug u Twist. Dawn il-fatturi jinibixxu l-espressjoni ta' markaturi epiteljali u jippromwovu l-espressjoni ta' markaturi mesenkimali, li jwasslu għall-akkwist ta' fenotip metastatiku (Casalino et al., 2023). Ġie osservat li MLK3 għandu rwol fir-rimudellar tal-ECM u l-attivazzjoni ta' proteasi bħal matrix metalloproteinasi (MMPs) li jiddegradaw l-ECM. Dan jiffaċilita l-invażjoni taċ-ċelluli tat-tumur u t-tixrid lejn siti 'l bogħod (Katari et al., 2019). Għalhekk, studji preċedenti wrew li MLK3 għandu rwol kritiku fit-TNBC. Rattanasinchai u Gallo użaw mudelli TNBC biex jistudjaw ir-rwol ta' MLK3 u sabu li jippromwovi l-iżvilupp tal-kanċer permezz ta' mogħdijiet ta' sinjalazzjoni speċifiċi. Huma użaw CRISPR/Cas9n biex jeditjaw MLK3 u osservaw tnaqqis sinifikanti fil-metastasi TNBC (Rattanasinchai u Gallo, 2016).
dCas9, spiss imsejjaħ Cas9 inattiv, huwa forma derivattiva modifikata tal-proteina Cas9. B'differenza minn Cas9 attiv, dCas9 m'għandux attività ta' endonuclease, u b'hekk ma jistax jikkaġuna ksur tad-DNA b'żewġ linji. Għalhekk, dCas9 jista' jintuża biex jimmira preċiżament lejn reġjuni speċifiċi tal-ġenoma mingħajr ebda tibdil jew modifika fis-sekwenza tad-DNA (Wang et al., 2016). F'dCas9, żewġ proteini endonuclease, RuvC u HNH, huma inattivati ​​billi jissopprimu residwi importanti ta' amino acidi. (Richter et al., 2016). Minkejja n-nuqqas ta' attività ta' qsim tad-DNA, dCas9 għandu numru ta' rwoli importanti fir-riċerka ġenetika u l-bijoteknoloġija. Pereżempju, jippermetti l-viżwalizzazzjoni ta' reġjuni speċifiċi tal-ġenoma, jiffaċilita r-regolazzjoni traskrizzjonali, u jippromwovi modifiki epiġenetiċi (Brocken et al., 2018).
Il-fattur ta' traskrizzjoni ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) għandu rwol speċifiku u kritiku fil-medjazzjoni tat-tranżizzjoni epiteljali-mesenkimali (EMT), proċess ċellulari li jseħħ waqt l-iżvilupp embrijoniku, it-tiswija tat-tessuti, u l-progressjoni tal-kanċer. Jinvolvi t-trasformazzjoni taċ-ċelloli epiteljali f'ċelloli mesenkimali, li tirriżulta f'bidliet fil-morfoloġija taċ-ċelloli, il-motilità, l-invażività, eċċ. (Wu et al., 2020). ZEB1 jinibixxi diversi markaturi epiteljali, bħal E-cadherin u Occludin, li huma responsabbli biex iżommu l-adeżjoni bejn iċ-ċelloli u l-polarità taċ-ċelloli epiteljali fit-TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Barra minn hekk, ZEB1 jattiva ċerti markaturi bħal N-cadherin, vimentin u fibronectin (Konradi et al., 2014) u jirregola wkoll ġeni involuti fir-rimudellar ċitoskeletali bħal Rho GTPases u matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang et al., 2014). 2022), barra minn hekk, jaffettwa wkoll diversi mogħdijiet ta' sinjalazzjoni bħal transforming growth factor-β (TGF-β), sinjalazzjoni Wnt, eċċ., u b'hekk jippromwovi l-invażjoni tat-tumur u l-metastasi fit-TNBC (Chen et al., 2016). Bosta studji u evidenza xjentifika jindikaw li ZEB1 għandu potenzjal kbir bħala aġent siewi għad-detezzjoni u l-intervent terapewtiku tat-TNBC. Fi studju reċenti, Waryah et al. użaw mudell TNBC u kisbu soppressjoni kompleta ta' ZEB1 minn dCas9. Għalhekk, osservaw speċifiċità għolja ħafna u inibizzjoni kważi kompleta ta' ZEB1 f'kundizzjonijiet in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 hija għodda għall-editjar tal-ġeni msejħa CRISPR/Cpf1. Hija derivata mis-sistema CRISPR/Cas, fejn it-terminu Cas12 jirreferi għall-proteina 12 assoċjata ma' CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), li hija kompletament simili għal Cas9. L-unika differenza hija li fiha l-proteina Cas12. Meta mqabbla ma' Cas9, Cas12 għandha xi funzjonijiet uniċi bħall-ġenerazzjoni ta' truf li jwaħħlu waqt il-proċess tal-editjar tal-ġeni, filwaqt li Cas9 tiġġenera truf ċatti (Wang et al., 2021). Din il-proprjetà ta' Cas12 tikkontribwixxi għat-teknoloġija speċifika tagħha għall-manipulazzjoni tad-DNA. Bħala proteina kapaċi li tagħraf u taqta' b'mod preċiż id-DNA fil-mira, għandha versatilità straordinarja, li tagħmilha għodda effettiva għal varjetà ta' applikazzjonijiet, inkluż l-editjar tal-ġeni (Pickar-Oliver u Gersbach, 2019).
Simili għal varjanti oħra ta' CRISPR, CRISPR/Cas12 huwa wkoll kapaċi li jneħħi jew jattiva ġeni fit-TNBC, billi jimmira lejn ġeni li għandhom rwol importanti fil-patoġenesi jew ir-rispons għat-trattament tiegħu (Yang u Zhang, 2023). Biex jitwettaq dan il-proċess, ġie żviluppat RNA gwida (gRNA) li jidderieġi Cas12 lejn il-ġene fil-mira. Ladarba Cas12 jingħaqad mal-mira tiegħu, jintroduċi ksur doppju fid-DNA u jattiva mekkaniżmi ta' tiswija tad-DNA. Matul il-proċess ta' tiswija, jistgħu jiġu inkorporati nukleotidi żbaljati, li jwasslu għal mutazzjonijiet tal-ġeni u telf ta' funzjoni (Zhang et al., 2021a). Barra minn hekk, intużat ukoll verżjoni mtejba tal-enzima Cas12 (imsejħa dCas12) biex tattiva l-ġeni. Billi tgħaqqadha ma' attivatur tat-traskrizzjoni, huwa possibbli li jiġu indotti ċerti ġeni, u b'hekk jiġu attivati. Din it-teknoloġija għandha potenzjal kbir fil-promozzjoni tal-attivazzjoni ta' ġeni li jrażżnu t-tumur (Sultan et al., 2022).
L-editjar tal-primer huwa teknoloġija ta' editjar tal-ġenoma żviluppata ġdida u estremament superjuri. Hija kapaċi timmodifika d-DNA ta' organiżmu b'mod preċiż ħafna (Chen u Liu, 2023). L-editjar tal-primer jinkiseb permezz tal-integrazzjoni ta' żewġ komponenti ewlenin: enzima CRISPR/Cas9 modifikata u transcriptase inversa. Ir-rwol tal-enzima CRISPR/Cas9 huwa li timmira b'mod selettiv siti preċiżi fil-ġenoma, filwaqt li r-reverse transcriptase tgħin biex timmodifika bir-reqqa d-DNA fil-post fil-mira (Hassan et al., 2021). Fil-mekkaniżmu ta' editjar tal-primer, l-ewwel pass jinvolvi l-ħolqien ta' RNA gwida għall-editjar tal-primer (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Fiha s-sekwenza fil-mira u t-template tal-RNA li jikkorrispondi għas-sit ta' editjar mixtieq fid-DNA fil-mira. Il-pegRNA mbagħad jiġi introdott fiċ-ċelloli fil-mira flimkien ma' nukleażi tal-editjar tal-primer (PE2). Il-PE2 hija proteina ta' fużjoni li tikkonsisti minn enzima Cas9, transcriptase inversa, u adapter tal-editjar tal-primer (Martín-Alonso et al., 2021). Ġewwa ċ-ċellula, il-kumplessjonijiet tal-pegRNA u tal-PE2 ifittxu d-DNA speċifiku li jridu jimmodifikaw. L-enzima Cas9 taqta’ d-DNA u toħloq mudell li jikkonsisti minn linji singoli (Choi et al., 2022). Ir-reverse transcriptase tuża dan il-mudell biex tipprepara d-DNA għall-editjar. Flimkien mal-ikkupjar tad-DNA, huma inklużi wkoll struzzjonijiet għall-editjar tal-mudell tal-RNA. Fl-aħħar nett, il-linja tad-DNA li għadha kif inħolqot tintuża bħala mudell biex isewwi l-qasma fid-DNA, li tirriżulta f’sekwenza tad-DNA mibdula li fiha l-modifika mixtieqa (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Il-mekkaniżmi tal-editjar tal-primer jistgħu jwasslu għal mutazzjonijiet mifruxa fil-ġeni. Jista’ jimmira lejn mutazzjonijiet puntwali, inserzjonijiet, tħassir, u anke sostituzzjonijiet tal-ġeni (Anzalone et al., 2019; Chen u Liu, 2023). L-editjar tal-primer joffri diversi vantaġġi fuq teknoloġiji preċedenti tal-editjar tal-ġenoma. Dawn jinkludu preċiżjoni akbar, effetti mnaqqsa barra mill-mira, u l-abbiltà li teditja d-DNA mingħajr ma tiddependi fuq ksur tad-DNA b’żewġ linji (Anzalone et al., 2020).
It-teknoloġija CRISPR/Cas9 ġiet żviluppata oriġinarjament biex tipproteġi l-batterji mit-trasferiment tal-plażmidi u l-infezzjoni tal-faġi u aktar tard ġiet użata mill-ġdid bħala għodda effettiva ta' mira tad-DNA bbażata fuq l-RNA għall-editjar tal-ġenoma (Jiang u Doudna, 2017). Barra minn hekk, is-sistema CRISPR/Cas9 ġiet irrappurtata li hija preżenti f'50% u 87% tal-ġenomi batteriċi u arkeali, rispettivament (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 hija għodda potenzjali għat-tħassir, l-inserzjoni u l-korrezzjoni ta' kwalunkwe sekwenza ġenetika anormali bl-użu ta' modi in vivo u in vitro (Sabit et al., 2021). Barra minn hekk, CRISPR/Cas9 intwera li huwa parti mis-sistema immunitarja adattiva minħabba l-ispeċifiċità tagħha għall-ġeni fil-mira ta' interess (Chen u Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 jikkonsisti minn Cas9 u RNA gwida waħda (sgRNA). Cas9 hija endonukleażi magħmula minn diversi komponenti ta' proteini. Barra minn hekk, Cas9 għandha proprjetajiet strutturali u konformazzjonali uniċi (Pacesa et al., 2022) peress li tikkonsisti f'żewġ lobi: rikonoxximent (REC) u nukleażi (NUC). Il-lobu REC huwa maqsum aktar fi tliet reġjuni: REC1, REC2, u eliċi tal-pont (Cromwell et al., 2018). L-NUC tikkonsisti fi tliet lobi, jiġifieri RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH u d-dominju ta' interazzjoni tal-motiv adjaċenti tal-protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA tikkonsisti f'żewġ komponenti, inkluż CRISPR RNA (crRNA) u transcoding small RNA (tracer RNA) (Figura 1). L-sgRNA jgħaqqad il-proteina Cas9 mal-konnexins biex jifforma kumpless attiv, magħruf ukoll bħala l-kumpless effettur (Richter et al., 2012). Is-crRNA huwa par bażi ta' 18–20 nukleotidi li għandu rwol kritiku fir-rikonoxximent tas-sekwenzi tad-DNA fil-mira. Barra minn hekk, is-crRNA jingħaqad mad-DNA fil-mira, u t-tracrRNA jaġixxi bħala scaffold għan-nukleażi Cas9 biex torbot mad-DNA fil-mira (Manghwar et al., 2019). Min-naħa l-oħra, is-sekwenza PAM għandha 3 nukleotidi, li jikkonfermaw, jispeċifikaw u jimmedjaw ir-rabta tal-kumpless effettur mad-DNA. Is-subunitajiet tal-kumpless tal-proteina Cas9 RuvC u HNH għandhom attività katalitika (Richter et al., 2012; Asmamaw u Zawdie, 2021). Id-dominju tan-nukleażi HNH tas-subunità Cas9 jaqsam il-linja tad-DNA assoċjata mas-crRNA. Id-dominju nukleażi RuvC jaqsam linji oħra tad-DNA u jiġġenera ksur f'żewġ linji (DSBs), u wara dan jiġu attivati ​​żewġ mekkaniżmi differenti ta' tiswija ta' ksur fid-DNA (Jiang u Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Ħarsa ġenerali lejn CRISPR/Cas9 (A). Komponenti tas-sistema CRISPR/Cas9: (i). L-endonukleażi Cas9 hija responsabbli għat-tqattigħ tas-sekwenza tad-DNA fil-mira, (ii) RNA gwida waħda (sg) li tirriżulta mill-fużjoni ta' kimeri crRNA u tra-crRNA. (tnejn). Cas9 jinkludi diversi komponenti bħal Rec I, Rec II, lobu NUC (HNH u Ruv C huma sottokomponenti) u dominju ta' interazzjoni PAM (C) b'funzjonijiet korrispondenti. Il-kumpless tal-proteina CRISPR/Cas9 jaqsam is-sekwenzi tad-DNA f'forom mhux komplementari u komplementari (D). CRISPR/Cas9 jeditja l-ġenoma fi tliet stadji: rikonoxximent, qtugħ u tiswija. L-sg-RNA ddisinjat jiggwida lil Cas9 u jirrikonoxxi s-sekwenza mixtieqa permezz tal-komponent komplementari crRNA. Cas9 jirrikonoxxi s-sekwenza PAM f'5′-NGG-3′ u jdub id-DNA, u jifforma ibridu DNA-RNA u jattiva t-tqattigħ. Id-dominju HNH ta' Cas9 jaqsam il-linja komplementari, u d-dominju RuvC jaqsam il-linja mhux komplementari. CRISPR/Cas9 isewwi d-DNA doppju billi jkissru b'żewġ modi: ngħaqda ta' tmiem mhux omologu (NHEJ) u tiswija diretta mill-omoloġija (HDR). L-NHEJ isewwi d-DNA b'żewġ linji fin-nuqqas ta' DNA omologu barrani permezz ta' proċess enżimatiku, mekkaniżmu suxxettibbli għall-iżbalji li jista' jdaħħal jew ineħħi sekwenzi ta' DNA każwali. L-HDR huwa speċifiku ħafna u jeħtieġ mudelli ta' DNA omologi.
Il-mogħdijiet ta' tiswija medjati minn CRISPR/Cas9 jinkludu mekkaniżmi ta' tiswija diretta bl-omoloġija (NHEJ) u ta' tiswija mhux omologa (HDR). L-NHEJ hija mogħdija suxxettibbli għall-iżbalji għaliex tinvolvi inserzjoni jew tħassir u ma teħtieġ l-ebda mudell matul il-mekkaniżmu ta' tiswija. Tuża nukleotidi każwali biex tiġġenera proteini standard (Abbasi et al., 2021). Din is-sistema ta' tiswija tikkonsisti f'erba' kumplessi bħall-kumpless KU, il-kumpless tal-proteini li jikkomplementa inkroċjat tat-tip 4 (XRCC-4), l-enzima tal-ipproċessar tat-tarf tad-DNA, u l-proteina kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Il-proteina kumplessa KU għandha żewġ subunitajiet, Ku 70 u Ku 80, u għandha rwol importanti fil-mekkaniżmu NHEJ, peress li l-mekkaniżmu tat-tiswija jinbeda mir-rabta ta' żewġ subunitajiet (Ku 70 u Ku 80) mat-truf ċatti jew kważi ċatti tad-DNA fil-mira (Abbasi et al., 2021), u jservi bħala scaffold biex jirrekluta fatturi oħra relatati man-NHEJ fis-sit tal-ħsara (Yang et al., 2020). XRCC-4 u DNA ligase huma magħmula minn 334 u 911 aċidu amminiku, rispettivament, u l-kumpless XRCC4-DNA ligase IV jistimula l-ligazzjoni tat-truf tad-DNA (Chatterjee et al., 2015). L-enzima tal-ipproċessar tat-truf tad-DNA, magħrufa wkoll bħala polynucleotide kinase 3′-phosphate, hija enzima tal-ipproċessar tat-truf tad-DNA. Tista' tneħħi l-grupp 3′P fid-DNA u tifosforila l-grupp 5′OH waqt it-tiswija DSB. Tinvolvi wkoll it-tiswija ta' ksur ta' strand wieħed (SSBs) bl-użu tal-mogħdija tat-tiswija SSB (Chatterjee et al., 2015). Il-proteina kinase DNA-PKcs hija proteina kinase dipendenti mid-DNA li tikkonsisti f'subunità katalitika tal-PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) u l-familja mutata ta' ataxia telangiectasia (ATM), kif ukoll ATRs relatati ma' ATM u Rad3. ksur ta' strand (DSBs) u ksur ta' strand wieħed (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
L-HDR huwa mekkaniżmu ta' tiswija aktar preċiż u adattat għaliex l-informazzjoni tiġi kkupjata bl-użu tal-forma intatta tad-duplex tad-DNA omologu, għalkemm jeħtieġ il-preżenza ta' kromatidi oħt. Dan iseħħ matul il-fażi S/G2 taċ-ċiklu taċ-ċelluli tal-mammiferi. L-HDR iseħħ prinċipalment fl-ispeċi tal-ħmira, iżda l-NHEJ huwa kritiku fil-mammiferi (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Il-mekkaniżmu sħiħ ta' tiswija huwa muri fil-Figura 1.
Peress li t-TNBC huwa kkawżat minn anormalitajiet ġenetiċi u epiġenetiċi, il-korrezzjoni ta' anormalitajiet ġenomiċi/epiġenomiċi malinni bl-użu ta' CRISPR/Cas9 tista' tkun approċċ terapewtiku raġonevoli (Chen et al., 2019). Barra minn hekk, xi fatturi ta' traskrizzjoni involuti fir-regolazzjoni traskrizzjonali speċifika għaċ-ċelloli jistgħu juru karatteristiċi uniċi taċ-ċelloli tal-kanċer, li jissuġġerixxu li r-regolazzjoni traskrizzjonali tista' tkun approċċ eċċellenti għat-trattament tal-kanċer (Drost et al., 2017). L-isfruttament ta' dawn il-karatteristiċi molekulari tat-tumuri, bħal difetti ġenetiċi, epiġenetiċi u traskrizzjonali, għall-iżvilupp ta' mediċini jista' jtejjeb ir-riżultati kliniċi u jnaqqas l-ispejjeż tal-iskrinjar. CRISPR hija għodda potenzjali għall-editjar tal-ġeni li tista' mhux biss tiskopri u tidentifika miri ġenomiċi li jikkawżaw il-kanċer, iżda tista' tintuża wkoll biex teditja, trażżan, u timmodifika epiġenetikament onkoġeni fiċ-ċelloli umani (Tabella 1) (Ahmed et al., 2021). Diversi skrins CRISPR twettqu biex ifittxu ġeni assoċjati ma' suppressuri tat-tumuri, onkoġeni, u reżistenza għall-mediċini. L-użu ta' CRISPR/Cas9 biex jiġu editjati diversi onkoġeni TNBC huwa muri fil-Figura 2.
Figura 2. Editjar tal-ġeni ta' diversi onkoġeni TNBC bl-użu ta' CRISPR/Cas9 li jirriżulta fi tnaqqis fit-tkabbir tat-tumur u l-metastasi. Dawn l-onkoġeni jinkludu CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 u CXCR7, Crypto1, ROR1 u ST8SIA, li huma involuti fl-okkorrenza u l-metastasi ta' TNBC.
Il-migrazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer, l-invażjoni, u t-tranżizzjoni epiteljali-mesenkimali (EMT) huma assoċjati ma' ITGA9. Studji preċedenti wrew li ITGA9 huwa attur ewlieni fil-mogħdija Notch u għandu rwol interessanti fil-metastasi tar-rabdomjosarkoma (Molist et al., 2020). Barra minn hekk, instab li ITGA9 huwa assoċjat mill-qrib mal-pronjosi tal-pazjent f'diversi tipi ta' tumuri, inkluż il-kanċer tas-sider (Wang Z. et al., 2019). Barra minn hekk, l-analiżi bijoinformatika ta' ITGA9 uriet li l-espressjoni tiegħu f'TNBC kienet sinifikament ogħla milli f'sottotipi oħra ta' kanċer tas-sider. Livelli elevati ta' ITGA9 huma assoċjati ma' metastasi tat-tumur u rikaduta f'pazjenti TNBC. It-tneħħija ta' ITGA9 minn CRISPR/Cas9 irriżultat fi proprjetajiet simili għaċ-ċelluli staminali tal-kanċer (CSC), anġjoġenesi tat-tumur, tkabbir tat-tumur, u metastasi mnaqqsa billi ppromwoviet id-degradazzjoni ta' β-catenin f'TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 huwa membru tal-familja TGF-β u huwa kritiku għall-embrijoġenesi bikrija, il-manutenzjoni taċ-ċelloli staminali, u l-metastasi tal-kanċer (Ishii et al., 2021). Magħruf ukoll bħala Tdgf-1, huwa proteina ta' sinjalazzjoni onkoġenika ankrata mal-GPI involuta fir-regolazzjoni tal-formazzjoni tal-istrixxa primittiva, il-mesoderm u l-endoderm, kif ukoll l-istabbiliment ta' assimetrija tax-xellug/lemin fl-iżvilupp tal-organi tal-ġisem waqt l-embrijoġenesi (Zhang et al., 2021b). Barra minn hekk, Cripto-1 intwera li huwa involut fit-tranżizzjoni epiteljali-mesenkimali (EMT) bħala markatur taċ-ċelloli staminali (Zhang et al., 2021b). L-EMT huwa kritiku mhux biss għal diversi proċessi bħall-iżvilupp embrijoniku, il-fibrożi u l-fejqan tal-feriti, iżda wkoll għall-invażjoni u l-metastasi tal-kanċer. Barra minn hekk, Cripto-1 intwera li jinteraġixxi ma' erba' riċetturi Notch u jtejjeb il-maturazzjoni post-traduzzjonali tagħhom (Brandstadter u Maillard, 2019). Il-mogħdija tas-sinjalar Notch hija magħrufa li hija involuta fil-manutenzjoni taċ-ċelloli tal-kanċer tas-sider uman. Studji wrew li t-tneħħija ta' CRYPTO-1 medjata minn CRISPR/Cas9 trażżan it-tkabbir u l-metastasi tal-kanċer. Għalhekk, Crypto-1 tista' ssir mira terapewtika importanti għat-TNBC (Castro et al., 2015).
Il-proteina XCL12 u r-riċettur tal-kemokini tagħha CXC (CXCR4 u CXCR7) għandhom diversi rwoli fil-proliferazzjoni, it-tkabbir, il-migrazzjoni u l-invażjoni taċ-ċelluli tal-kanċer (Wu et al., 2015). Dawn il-kemoreċetturi ġew assoċjati mal-iżvilupp ta' TNBC permezz ta' diversi mogħdijiet ta' sinjalazzjoni kemm f'mudelli in vivo kif ukoll in vitro (Wu et al., 2015). Barra minn hekk, l-attivazzjoni ta' CXCR4 u CXCR7 hija assoċjata ma' suxxettibilità akbar għall-metastasi u pronjosi ħażina f'TNBC (Karn et al., 2022). Għalhekk, it-tneħħija ta' CXCR4 u CXCR7 tista' ssir ġeni fil-mira effettivi għall-mediċini għat-trattament tal-kanċer tas-sider, inkluż TNBC. Studju minn Yang et al. Yang et al (2019) użaw CRISPR/Cas9 biex ineħħu flimkien il-ġeni CXCR4 u CXCR7 u sab li l-proliferazzjoni, it-tkabbir, il-migrazzjoni u l-invażjoni ta' TNBC kienu inibiti b'mod sinifikanti (Yang et al., 2019).
Żieda fil-livelli ta' miR-3662, onkoġene TNBC, ġiet osservata fit-tessuti tal-kanċer tas-sider (Yi et al., 2022). Intwera li t-tnaqqis ta' miR-3662 jinibixxi t-tkabbir u l-metastasi tat-tumur tal-kanċer tas-sider kemm in vivo kif ukoll in vitro (Agarwal u Gupta, 2021). HBP-1 huwa inibitur qawwi tas-sinjalar Wnt/-catenin u x'aktarx huwa responsabbli għat-tkabbir taċ-ċelloli TNBC medjat minn miR-3662. Riċentement, Yi et al. sabu li l-assi miR-3662-HBP1 jirregola l-mogħdija tas-sinjalar Wnt/-catenin fiċ-ċelloli TNBC (Yi et al., 2022). Minħabba l-espressjoni speċifika għat-tumur tiegħu, miR-3662 jista' jkun mira terapewtika potenzjali għat-TNBC. Għalhekk, it-tnaqqis ta' miR-3662 medjat minn CRISPR/Cas9 jista' jkun approċċ eċċellenti għall-iżvilupp ta' drogi ġodda għat-trattament tat-TNBC.
UBR5 hija nukleofosfoproteina ta' 300 kDa li ġiet identifikata bħala regolatur ewlieni tat-tumoriġenesi, il-metastasi, u r-rispons immuni f'diversi kanċers (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 ġie rrappurtat li huwa regolat ħafna 'l fuq f'kampjuni TNBC u jistimula l-funzjoni ERα billi jikkaġuna proliferazzjoni permezz tal-attività ubiquitin ligase tiegħu (Bolt et al., 2015). Studji ta' sekwenzjar tal-eżoma sħiħ ta' kampjuni TNBC primarji wrew ukoll żieda fl-espressjoni ta' UBR5, li jissuġġerixxi r-rwol tiegħu fl-iżvilupp ta' TNBC. Barra minn hekk, it-tħassir ta' UBR5 immexxi minn CRISPR/Cas9 wera inibizzjoni sinifikanti tal-metastasi u t-tkabbir ta' TNBC f'mudelli sperimentali tal-ġrieden. Barra minn hekk, l-inklużjoni ta' UBR5 f'mudell ta' ġrieden tat-tip selvaġġ irrestawrat il-funzjonalità sħiħa tiegħu, filwaqt li dan l-effett ma ġiex osservat f'razez mutanti inattivati ​​(Liao et al., 2017). In-nuqqas ta' UBR5 huwa assoċjat ma' żieda fl-apoptożi, nekrożi, u inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur fit-TNBC minħabba anġjoġenesi fqira. Minħabba t-telf ta' UBR5, it-tixrid tat-tumur għal organi 'l bogħod jitnaqqas, u UBR5 jikkaġuna EMT anormali prinċipalment billi jnaqqas l-espressjoni ta' E-cadherin (Zhang and Weinberg, 2018). Riċentement, UBR5 intwera li huwa fattur importanti ħafna fit-traskrizzjoni ta' PDL1 indotta minn IFN-γ fit-TNBC minħabba n-nuqqas ta' attività ta' ubiquitination ta' E3. L-analiżi tat-traskrittoma tal-RNA żvelat li UBR5 jista' jkollu effetti sistemiċi fuq ġeni assoċjati mal-mogħdija IFN-γ u jippromwovi t-transattivazzjoni ta' PDL1 billi jżid il-livelli ta' attivazzjoni ta' protein kinase RNA (PKR) u t-transducers u l-attivaturi tas-sinjali tiegħu. traskrizzjoni 1 (STAT1) u fattur regolatorju tal-interferon 1 (IRF1). Madankollu, l-ablazzjoni kkombinata medjata minn CRISPR/Cas9 tal-espressjoni ta' UBR5 u PD-L1 għandha effett terapewtiku sinerġistiku aktar minn kwalunkwe imblokk waħdu, b'effetti profondi fuq il-mikroambjent tat-tumur (Wu et al., 2022). Għalhekk, CRISPR/Cas9 jista' jkun għodda importanti biex jinibixxi l-funzjoni ta' UBR5, u b'hekk jrażżan il-metastasi tat-TNBC u t-tkabbir tat-tumur.
ROR1 hija proteina transmembrana tat-tip I li hija espressa waqt il-kanċer u l-iżvilupp embrijoniku u ġiet identifikata bħala proteina onkofetali (Nicholas Borcherding, 2014). L-imġiba invażiva ta' diversi kanċers umani hija assoċjata ma' żieda fir-regolazzjoni ta' ROR1. Inkisbu riżultati promettenti minn studji in vivo u in vitro li jinvolvu komposti terapewtiċi li jimmiraw lejn ROR1 (Chien et al., 2016). Livelli elevati ta' mRNA ta' ROR1 f'bijopsiji tat-tessut tas-sider ġew assoċjati wkoll ma' tumuri aggressivi tas-sider li jixbħu dawk bażali (BL) u l-migrazzjoni tagħhom lejn partijiet oħra tal-ġisem. Barra minn hekk, l-espressjoni żejda ta' ROR1 ġiet identifikata bħala markatur prognostiku għall-iżvilupp ta' TNBC (Chien et al., 2016). Madankollu, is-silenzju ta' ROR1 bl-użu ta' CRISPR/Cas9 biex jissopprimi t-tkabbir u l-metastasi tat-TNBC ikun strateġija effettiva.
Il-proċess ta' sialilazzjoni jinvolvi ż-żieda ta' aċidu sjaliku mal-glikokonjugati, li huwa katalizzat minn sialiltransferasi (STs). ST8SIA1 jappartjeni għall-familja ST u għandu rwol importanti fil-patoġenesi ta' diversi mard bħal-lewkimja limfoċitika u l-kanċer kolorektali (Chang et al., 2018). L-analiżi tas-sekwenza tal-RNA turi li ST8SIA1 huwa espress ħafna fit-tessut tas-sider ta' pazjenti TNBC u huwa korrelat b'mod pożittiv ma' mutazzjonijiet fil-ġene tas-soppressur tat-tumur p53, li jistgħu jikkontribwixxu għall-patoġenesi tat-TNBC (Battula et al., 2017). Barra minn hekk, ST8SIA1 huwa involut fil-metastasi u r-rikorrenza tat-TNBC, li jissuġġerixxi li għandu rwol importanti fl-okkorrenza u l-iżvilupp tat-TNBC. F'mudell in vitro tat-TNBC, intwera li t-tnaqqis ta' ST8SIA1 minn CRIPSR/Cas9 jimblokka t-tkabbir u l-metastasi (Battula et al., 2017). Dan jissuġġerixxi li CRISPR/Cas9 jista' jkun għodda importanti biex tinibixxi l-funzjoni tal-onkoġene ST8SIA1 fit-trattament ta' TNBC.
NAT1 huwa enzima metaboliku li jikkatalizza l-formazzjoni ta' komposti ksenobijotiċi tal-fażi II u huwa espress fi kważi t-tessuti umani kollha. NAT1 jista' juża l-kofattur folate biex jimmira lejn l-acetyl-CoA (acetyl-CoA) anke fin-nuqqas tas-sottostrat tal-amina aromatika (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studji wrew li NAT1 jirregola l-funzjoni tal-matrix metalloproteinase 9 (MMP9) f'mudelli ta' ċelluli tal-kanċer tas-sider u jipproteġi kontra speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) waqt in-nuqqas ta' glukożju (Wang et al., 2018). It-tħassir ta' NAT1 intwera li jinibixxi l-kumpless tal-pyruvate dehydrogenase, li jwassal għal disfunzjoni mitokondrijali (Wang L. et al., 2019). Barra minn hekk, diversi rapporti oħra wrew li l-inibizzjoni ta' NAT1 bl-użu ta' molekuli żgħar u silencing tas-siRNA tista' tnaqqas l-invażività u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider (Stepp et al., 2018). Riċentement, CRISPR/Cas9 intuża biex jrażżan NAT1 fil-linja taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider MDA-MB-231, u dan affettwa l-metaboliżmu ċellulari skont il-livell ta' espressjoni tiegħu. Dan l-istudju wera wkoll li NAT-1 huwa kritiku għall-progressjoni u l-metastasi ta' TNBC (Carlisle et al., 2020).
It-traskrizzjoni kkoordinata tal-onkoġeni hija regolata minn super enhancers, fatturi ta' traskrizzjoni u kofatturi (Hnisz et al., 2015). Barra minn hekk, grupp ta' kinases dipendenti fuq iċ-ċiklina (CDKs), bħal CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, u CDK13, huma meħtieġa għar-regolazzjoni tat-traskrizzjoni. Fost dawn, CDK7 hija involuta fil-fosforilazzjoni tal-RNA polymerase II, li hija importanti ħafna għall-bidu u l-espansjoni tat-traskrizzjoni tal-onkoġeni fil-patoġenesi tat-TNBC. Fi studju importanti, it-tħassir ta' CDK7 minn CRISPR/Cas9 inibixxa t-TNBC, li jindika li l-patoġenesi tat-TNBC hija dipendenti fuq CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studji wrew li mutazzjonijiet f'MYC u RBP (proteina li torbot l-RNA) jistgħu jwasslu għal apoptożi, filwaqt li mutazzjonijiet ta' ġene wieħed f'MYC jew RBP ma jaffettwawx it-tkabbir taċ-ċelloli tal-kanċer (Einstein et al., 2021). Aktar minn 1000 RBP fil-ġenoma tal-bniedem ġew skrinjati bl-użu ta' librerija bbażata fuq CRISPR/Cas9. Fosthom, 57 RBP instabu li huma kritiċi għat-tkabbir taċ-ċelloli tal-kanċer b'livelli elevati ħafna ta' MYC (Wheeler et al., 2020). Barra minn hekk, YTHDF2 huwa importanti biex jinżamm it-tkabbir taċ-ċelloli TNBC u jnaqqas l-ammont ta' traskrizzjonijiet metilati waqt traskrizzjoni u traduzzjoni ta' livell għoli f'ċelloli tal-kanċer b'espressjoni ogħla ta' MYC. Barra minn hekk, YTHDF2 mhuwiex essenzjali għaċ-ċelloli tal-kanċer, li huma inqas dipendenti fuq livelli elevati ta' MYC biex itawlu s-sopravivenza tal-pazjenti TNBC (Einstein et al., 2021), li jissuġġerixxi li jista' jkun mira terapewtika potenzjali għal drogi li jistgħu jegħlbu t-TNBC.
Il-proteini taż-żingu (ZNFs) jiffurmaw madwar 1% tal-ġenoma uman totali. Studji wrew li ż-ZNF jista' jirregola l-proliferazzjoni taċ-ċelloli f'diversi kanċers, bħall-kanċer tal-fwied, il-kanċer tas-sider u l-kanċer kolorektali (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Libreriji ġġenerati minn CRISPR knockout intużaw biex jiġu skrinjati diversi ġeni li jrażżnu t-tumur (TSGs) fiċ-ċelloli tal-kanċer tas-sider (Shalem et al., 2014). Minn dakinhar, studju traskrittomiku taċ-ċelloli tal-kanċer tas-sider CRISPR/Cas9 b'ZNF319 imħassar wera li ż-ZNF319 huwa ġene li jrażżan it-tumur li jnaqqas il-proliferazzjoni tal-kanċer tas-sider u għalhekk huwa involut f'diversi mekkaniżmi potenzjali ta' sinjalazzjoni u funzjonijiet bijoloġiċi oħra (Wang L. et al., 2022).
Il-ferroptożi hija tip ta’ mewt taċ-ċelluli programmata li tiddependi fuq il-preżenza tal-ħadid. Huwa magħruf li l-iżvilupp tal-ferroptożi huwa influwenzat mill-preżenza ta’ perossidi tal-lipidi. Barra minn hekk, ġie rrappurtat li l-PKCβII juri perossidazzjoni bikrija tal-lipidi, u żieda fil-perossidazzjoni tal-lipidi hija assoċjata mal-ferroptożi. L-iskrinjar ta’ librerija ta’ inibituri tal-kinażi medjati minn CRISPR/Cas9 żvela li l-PKCβII huwa involut fil-proċess ta’ perossidazzjoni tal-lipidi, li huwa kritiku għall-ferroptożi fiċ-ċelluli MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Għalhekk, dan jissuġġerixxi li t-tneħħija tal-PKCβII minn CRISPR/Cas9 tista’ tkun mira potenzjali ta’ ġene li jrażżan it-tumur għat-trattament ta’ mard relatat mal-ferroptożi (Zhang et al., 2022).
Ir-reżistenza għall-mediċini hija maħsuba li hija responsabbli għal madwar 90% tal-imwiet f'pazjenti bil-kanċer u hija waħda mill-isfidi ewlenin fit-trattament tal-kanċer (Bukowski et al., 2020). Ir-riżultati jindikaw li numru suffiċjenti ta' ġeni relatati mal-effluss tal-mediċini, it-tiswija tad-DNA, l-apoptożi u diversi mogħdijiet ta' sinjalazzjoni taċ-ċelluli huma assoċjati mar-reżistenza għall-mediċini (Haider et al., 2020). Fost dawn, diversi ġeni ġew immirati mill-għodod CRISPR/Cas9 u wrew riżultati promettenti fit-tnaqqis tar-reżistenza għall-mediċini u ż-żieda tal-effettività tat-trattamenti kontra l-kanċer (Vaghari-Tabari et al., 2022). Barra minn hekk, libreriji ta' skrinjar ta' knockout tal-ġene CRISPR/Cas9 b'rendiment għoli ġew implikati fil-modifika tal-funzjoni ta' miri potenzjali tal-ġeni tar-reżistenza għall-mediċini (Shalem et al., 2015). Biex jiġu identifikati l-ġeni tar-reżistenza għall-paclitaxel, intuża s-sekwenzar tal-RNA flimkien mal-iskrinjar tal-librerija sgRNA tal-ġenoma kollha biex jiġu identifikati tmien ġeni kandidati, inkluż histone deacetylase 9 (HDAC9), li huma assoċjati mar-reżistenza għall-mediċini f'pazjenti b'TNBC rikorrenti (B et al., 2020). Fi studju ieħor, ġiet osservata żieda fl-espressjoni ta' diserine/threonine u tyrosine protein kinase (DSTYK) waqt is-sopravivenza ta' pazjenti TNBC ittrattati b'mediċini kontra l-kanċer. Barra minn hekk, it-tnaqqis tad-DSTYK medjat minn CRISPR/Cas9 tejjeb b'mod sinifikanti l-apoptożi taċ-ċelloli tal-kanċer reżistenti għall-mediċini in vitro (ċelloli SUM102PT u ċelloli MDA-MB-468) u mudell TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Għalkemm it-TNBC għandu attivazzjoni anormali tal-mogħdija MAPK, l-effett kliniku tat-terapiji mmirati lejn il-MEK huwa fqir. Skrinjar tal-librerija ġenomika CRISPR/Cas9 żvela li l-inibizzjoni ta' PSMG2 (chaperone 2 tal-assemblaġġ tal-proteome) tissensibilizza ċ-ċelloli TNBC BT549 u MB468 għall-inibitur tal-MEK AZD6244. It-tnaqqis ta' PSMG2 minn CRISPR/Cas9 biddel il-funzjoni normali tal-proteasoma, u wassal għal żarmar ta' PDPK1 medjat mill-awtofaġija, u b'hekk itejjeb aktar iċ-ċelloli tat-tumur fil-mudelli tal-ġrieden TNBC indotti minn AZD6244 (inibitur tal-MEK) u MG132 (inibitur tal-proteasoma). Għalhekk, l-inibituri tal-proteasoma u tal-MAP kinase (MEK) jistgħu jingħataw b'mod sinerġistiku biex inaqqsu l-proliferazzjoni taċ-ċelloli tat-tumur (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 intuża wkoll biex jiġi skrinjat it-telf tal-funzjoni tal-ġeni li twassal għal reżistenza għat-TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al spjegaw il-mekkaniżmu tar-reżistenza għall-mediċini taċ-ċelloli tal-kanċer ittrattati b'JQ1, inibitur tal-bromodomain BET (BBDI), fit-TNBC. Bl-użu ta' CRISPR/Cas9, sabu li t-tħassir tal-ġene rb1 ikkawża li t-TNBC isir reżistenti għall-mediċina kontra l-kanċer JQ1. Għalhekk, il-funzjoni rb1 hija importanti fir-rispons għall-mediċini JQ1 fit-TNBC. Huma rrappurtaw ukoll li paclitaxel huwa inibitur tal-kinażi/mikrotubuli CDK4/6, u l-kombinazzjoni tiegħu ma' BBDIs bħal JQ1 tista' tipprovdi risponsi terapewtiċi promettenti għal TNBC reżistenti għall-mediċini (Ge et al., 2020).
Il-pajsaġġ traskrizzjonali tal-RNA twil mhux kodifikanti (lncRNA) ġie rrappurtat li huwa responsabbli għar-reżistenza għat-terapija neoadjuvant fit-TNBC. Dan l-istudju juri li ħames traskrizzjonijiet differenti ta' MALAT1 lncRNA huma espressi ħafna fit-TNBC. Barra minn hekk, it-tħassir ta' MALAT1 medjat minn CRISPR/Cas9 żied is-sensittività taċ-ċelloli TNBC BT-549 għal paclitaxel u doxorubicin, li jissuġġerixxi rwol potenzjali għar-reżistenza għal MALAT1 fit-TNBC (Shaath et al., 2021).
Il-mutazzjonijiet f'BRCA1 (BRCA1m) huma eteroġenji u għalhekk diffiċli biex jiġu skoperti. L-immirar ta' PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), is-sieħeb letali sintetiku ta' BRCA1, jista' jżid il-kemosensittività għall-mediċini TNBC. Bl-użu ta' CRISPR/Cas9, it-tħassir ta' PARP1 żied is-sensittività ta' mediċini kontra l-kanċer bħal doxorubicin, gemcitabine u docetaxel għal ċelloli TNBC mutanti mBRCA1, li jissuġġerixxi li PARP1 huwa involut ukoll fir-reżistenza għall-mediċini f'TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutazzjonijiet fil-ġeni tas-soppressjoni tat-tumur BRCA1 jew BRCA2 huma magħrufa li jżidu l-probabbiltà li jiżviluppa kanċer tas-sider fin-nies. Il-kura ta' dawn il-pazjenti teħtieġ l-użu ta' inibituri PARP. Barra minn hekk, intwera li t-tneħħija tal-fattur ta' salvataġġ tan-nukleotidi DNPH1 bl-użu ta' CRISPR/Cas9 tista' tneħħi n-nukleotidi tossiku 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monophosphate, u b'hekk ittejjeb ir-rispons taċ-ċelloli defiċjenti fil-BRCA għas-sensittività għall-inibituri PARP (Fugger et al., 2021). Għalhekk, l-inibituri CRISPR/Cas9 u PARP1 jistgħu jsiru strateġija importanti ta' trattament għat-TNBC.
Il-ġene tal-glikoproteina penetranti (P-gp) huwa ġene ta' reżistenza għal diversi mediċini li ġeneralment huwa regolat 'il fuq f'madwar 41% tat-TNBC kollha (Sun et al., 2020). L-effluss tal-mediċina indott minn P-gp ġie identifikat bħala regolatur ewlieni tar-reżistenza għall-mediċini fil-kanċer tas-sider. L-inibituri ta' P-gp urew sensittività akbar għal mediċini kontra l-kanċer fil-kanċer tas-sider (Famta et al., 2021). Għalhekk, l-ablazzjoni jew is-soppressjoni medjata minn CRISPR/Cas9 ta' P-gp u inibituri ta' P-gp jistgħu jkunu metodi importanti ħafna biex tingħeleb ir-reżistenza għall-mediċini fit-TNBC.
It-trasportatur tal-cassette li jorbot l-ATP G2 (ABCG2) huwa magħruf li jikkawża reżistenza għall-mediċini fit-TNBC (Palasuberniam et al., 2015), għalkemm bħalissa m'hemm l-ebda rapport dwar ir-relazzjoni bejn is-silenċjar ta' CRISPR/Cas9 u ABCG2 u l-inattivazzjoni tal-ġeni tas-soppressjoni tat-tumuri. PTEN jista' jsaħħaħ l-attivazzjoni ta' ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Għalhekk, l-użu ta' CRISP/Ca9 biex jitneħħa ABCG2 u l-kombinazzjoni tiegħu ma' inibitur ABCG2 jista' jkun trattament adattat biex tingħeleb ir-reżistenza għall-mediċini fit-TNBC. It-Tabella 2 issemmi CRISPR/Cas9 li jimmira lejn il-ġeni kollha tar-reżistenza.
Tabella 2. CRISPR/Cas9 jimmira lejn diversi ġeni ta' reżistenza għat-TNBC biex jissensibilizza ċ-ċelloli għal mediċini kontra l-kanċer.
Il-libreriji CRISPR/Cas9 huma għodod potenzjali għall-iskrinjar ta' mutazzjonijiet tal-ġeni assoċjati mal-patoġenesi tal-kanċer (Chan et al., 2022). Dan il-metodu ta' skrinjar jinvolvi erba' passi bħal (a) kostruzzjoni ta' librerija, (b) trasduzzjoni lentivirali, (c) skrinjar fenotipiku, u (d) analiżi tal-ġeni fil-mira. Għalkemm it-TNBC għandu attivazzjoni anormali tal-mogħdija MAPK, il-pronjosi klinika tat-terapija mmirata lejn l-MEK għal pazjenti bit-TNBC li jġorru mutazzjonijiet f'ġeni li jrażżnu t-tumur bħal PTEN, RB1, u TP53 hija fqira ħafna.
Barra minn hekk, skrinjar ta' gene knockout bl-użu ta' CRISPR/Cas9 ittestja l-aktar molekula qawwija u selettiva, dehydrocatrol, li hija abbundanti fl-estratti tal-fjuri u l-weraq tal-Gwatemala, biex jifhem l-effett tad-dehydrocatrol fuq MDA-MB-231. Mekkaniżmi ta' ċitotossiċità selettiva taċ-ċelluli. Karatteristiċi taz-zokk mesenkimali tas-sottotipi TNBC. Dan l-iskrinjar ibbażat fuq CRISPR/Cas9 żvela wkoll li HSD17B11, ġene li jikkodifika 17β-hydroxysteroid dehydrogenase tip 11, huwa espress ħafna fiċ-ċelluli MDA-MB-231 u jirriżulta f'dehydrofalcarinol speċifiku għaċ-ċelluli MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Għalhekk, dan jissuġġerixxi li l-iskrinjar ġenomiku CRISPR/Cas9 għandu potenzjal kbir fl-identifikazzjoni tal-mekkaniżmi li fuqhom huma bbażati l-proprjetajiet kontra l-kanċer ta' komposti naturali potenzjali.
Barra minn hekk, il-vulnerabbiltà tat-TNBC għall-kanċer ġiet studjata bl-użu ta' skrin in vivo CRISPR/Cas9 mhux preġudikat fuq il-ġenoma kollu, li wera rabta bejn mogħdijiet onkoġeniċi u dawk li jrażżnu t-tumuri. Komponenti ewlenin tal-mogħdijiet mTOR u Hippo ġew irrappurtati li għandhom rwoli importanti fir-regolazzjoni tat-tumuri fit-TNBC. Barra minn hekk, studji wrew li l-inibizzjoni farmakoloġika tal-onkoproteina mTORC1/2 u YAP tinibixxi b'mod effettiv il-patoġeniċità tat-TNBC bl-użu ta' mudell ta' sinerġija bejn il-mediċina u l-matriċi u ksenografts derivati ​​mill-pazjent in vivo. Barra minn hekk, l-inibizzjoni ta' mTORC1/2 medjata minn Torin-1 ittejjeb il-makropinoċitożi, filwaqt li l-inibizzjoni ta' YAP indotta minn verteporfin twassal għall-mewt taċ-ċelluli TNBC. Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jenfasizzaw il-qawwa u r-robustezza tal-iskrining in vivo CRISPR fuq il-ġenoma kollu biex jiġu identifikati trattamenti ġodda u effettivi għat-TNBC (Dai et al., 2021).
Id-disregolazzjoni tas-sistema immunitarja hija fattur importanti fit-tumoriġenesi. Iċ-ċelloli tal-kanċer jevadu t-tneħħija immuni billi jinjoraw mekkaniżmi ta' difiża, inkluż li jinterferixxu mal-attività taċ-ċelloli immuni fil-mikroambjent tat-tumur u jikkompromettu s-sistema immunitarja. Għalhekk, l-iżvilupp ta' sistema immunitarja mtejba jista' jkun approċċ ewlieni għall-ġlieda kontra t-tumuri. L-użu tal-modifika tal-ġeni bbażata fuq CRISPR/Cas9 jindirizza diversi kwistjonijiet relatati mad-disfunzjoni immuni minn perspettivi differenti. CRISPR/Cas9 intuża biex itejjeb l-immunità kontra t-tumur kontra l-kanċer tas-sider permezz tal-mogħdijiet li ġejjin (Figura 3).
Figura 3. L-immunoterapija CRISPR/Cas9 timmira lejn iċ-ċelloli TNBC. It-telf ta' CDK5 u t-tnaqqis ta' PDL1 u CD155 isaħħu s-sistema immunitarja. Bl-istess mod, it-telf ta' A2AR u t-tnaqqis ta' TAAs bħal HER2, mucin 1 u TEM8 żiedu l-effiċjenza taċ-ċelloli CAR-T fil-qtil taċ-ċelloli tal-kanċer. L-iskrinjar taċ-ċelloli T immexxi minn CRISPR/Cas9 wera li t-tfixkil tal-kinażi p38 itejjeb l-attività antitumorali taċ-ċelloli T. Iċ-ċelloli T modifikati minn CRISPR/Cas9 iżidu l-espressjoni ta' TCR (riċettur taċ-ċelloli T), li jirriżulta f'ċelloli T li jkollhom attività antitumorali.
L-għan tal-immunoterapija huwa li tistimula s-sistema immunitarja biex tattakka ċ-ċelloli tal-kanċer. L-espressjoni żejda ta' proteini ta' checkpoint immuni ġeneralment tipprevjeni reazzjonijiet awtoimmuni iżda tista' tgħin lill-kanċer jevitahom (Topalian et al., 2015). Dawn il-proteini jipprevjenu reazzjonijiet immuni billi jorbtu ma' riċetturi fuq il-wiċċ taċ-ċelloli immuni. Proteini multipli ta' checkpoint (bħal CD155 u PD-L1) jimmiraw lejn ir-riċettur PD-1 fuq iċ-ċelloli immuni u huma espressi fil-kanċer tas-sider, speċjalment TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). It-tnaqqis ta' PD-L1 jew ir-riċettur tiegħu bl-użu ta' CRISPR/Cas9 jista' jistimula s-sistema immunitarja biex tattakka t-tumuri TNBC (Yahata et al., 2019). Barra minn hekk, intwera li t-tnaqqis tal-espressjoni ta' PD-L1 permezz tat-tħassir ta' CDK5 medjat minn CRISPR/Cas9 jinibixxi t-tkabbir tat-tumur in vitro u in vivo (Deng et al., 2020). L-inibizzjoni tat-tkabbir f'mudelli in vitro u in vivo tal-kanċer tas-sider tissuġġerixxi li t-tnaqqis ta' CD155 medjat minn shRNA jista' jkollu effett terapewtiku fuq il-kanċer tas-sider (Gao et al., 2018).
Iċ-ċelloli CAR T jesprimu CARs li jagħrfu antiġeni assoċjati mat-tumur (TAAs) u jistgħu jużaw it-tnaqqis tal-proteini tal-punti ta' kontroll biex itejbu l-attività tagħhom (Li C. et al., 2020). Hemm diversi miri potenzjali għat-terapija taċ-ċelloli CAR T fil-kanċer tas-sider, inklużi diversi TAAs bħal HER2, mucin1, u TEM8 (Bajgain et al., 2018). Hemm evidenza li ċ-ċelloli CAR T li jimmiraw lejn il-mesotelina (espressa żżejjed fiċ-ċelloli TNBC BT-459) huma aktar effettivi kontra l-kanċer meta PD-1 jiġi eliminat bl-użu ta' CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Madankollu, l-iżolament taċ-ċelloli T mill-pazjenti u mbagħad l-editjar tagħhom ex vivo huwa proċess li jieħu ħafna xogħol u ħafna ħin. Għalkemm iċ-ċelloli T universali jistgħu jnaqqsu r-rekwiżiti ta' iżolament, iċ-ċelloli T donaturi li jesprimu l-antiġen tal-lewkoċiti umani (HLA) tal-klassi I u r-riċettur taċ-ċelloli T (TCR) għandhom jitneħħew biex jiġu evitati anormalitajiet tat-tilqima kontra l-ospitant (Ren et al., 2017). , 2017a). Bl-użu ta' CRISPR/Cas9, l-HDR jista' jelimina simultanjament it-TCR u l-HLA u jneħħi l-ġene li jikkodifika s-CAR. Studji wrew li CRISPR/Cas9 jista' jintuża biex jintroduċi CARs anti-CD19 fil-locus tat-TCR, u b'hekk jipproduċi CARs b'mod effiċjenti mingħajr ma jnaqqas iċ-ċelloli T (Dimitri et al., 2022). Ġew żviluppati teknoloġiji multiplex biex jiġġeneraw ċelloli T CAR alloġeniċi billi jeliminaw simultanjament it-TCR, il-beta-2-mikroglobulina (B2M), is-subunità HLA-I u proteini oħra bħal PD-1 u CTLA-4, li jista' jkollhom proprjetajiet akbar kontra l-kanċer kontra t-TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
L-użu ta' CRISPR/Cas9 jista' jtejjeb l-effettività taċ-ċelloli CAR-T. L-adenosine huwa magħruf li għandu proprjetajiet immunosoppressivi u jista' jnaqqas l-immunità kontra l-kanċer billi jimblokka l-funzjoni taċ-ċelloli T u jattiva r-riċetturi tal-adenosine A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Is-silenzju tal-A2AR bl-użu ta' CRISPR/Cas9 tejjeb b'mod sinifikanti l-effikaċja taċ-ċelloli CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Iċ-ċelloli T huma magħrufa li juru diversi karatteristiċi fenotipiċi bħal espansjoni ċellulari, differenzjazzjoni, stress ossidattiv u stress ġenomiku. L-iskrinjar taċ-ċelloli T ibbażat fuq CRISPR/Cas9 żvela tfixkil ta' 25 kinase differenti tar-riċetturi taċ-ċelloli T. Fost dawn, it-tħassir tal-kinase p38 intwera li jtejjeb l-attività antitumorali taċ-ċelloli T, li jindika li l-kinase p38 huwa regolatur ewlieni tar-regolazzjoni taċ-ċelloli CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Iċ-ċelloli T jistgħu jiġu modifikati ġenetikament bl-użu ta' CRISPR/Cas9 biex jipproduċu TCRs espressi ħafna. It-trasferiment ta' ċelloli T modifikati ġenetikament lill-pazjenti wera attività kontra l-kanċer aktar b'saħħitha miċ-ċelloli T endoġeni. Għalhekk, it-TCRs endoġeni jistgħu jikkompetu ma' TCRs mibdula ġenetikament fil-pazjenti, li jista' jkollu impatt fuq il-potenzjal tal-immunoterapija tal-kanċer. Biex tingħeleb din il-problema, l-użu ta' CRISPR/Cas9 biex jitneħħa t-TCR-β endoġenu fiċ-ċelloli riċevituri u sussegwentement it-trasferiment taċ-ċelloli T TCR-β lill-pazjenti bil-kanċer jista' juri risponsi immuni kontra l-kanċer aħjar mingħajr il-ħtieġa għal kompetizzjoni sesswali endoġena tat-TCR (Fan et al. 2018). Għalhekk, bl-eċċezzjoni taċ-ċelloli T modifikati bil-CRISPR, it-TCRs huma elf darba aktar sensittivi għall-antiġeni tat-tumur miċ-ċelloli T trasdotti bit-TCR normali. Barra minn hekk, f'diversi lewkimji, ċelloli T mibdula ġġenerati minn γδ TCR+ CRISPR juru espressjoni ogħla ta' ċelloli T CD4+ u CD8+ mit-trasferiment standard tat-TCR (Legut et al., 2018). Għalhekk, ċelluli T modifikati ġġenerati minn CRISPR/Cas9 jistgħu jkunu metodu effettiv ta' immunoterapija biex jingħeleb it-TNBC.
L-integrini huma molekuli ta' adeżjoni taċ-ċelloli li huma preżenti fit-transmembrani ċellulari u jippromwovu l-irbit taċ-ċelloli mal-matriċi extraċellulari (ECM) (Hamidi u Ivaska, 2018). Id-disregolazzjoni tal-integrini hija assoċjata mal-iżvilupp u l-migrazzjoni tal-kanċer billi tbiddel il-matriċi extraċellulari, li twassal għas-sopravivenza taċ-ċelloli tal-kanċer fiċ-ċirkolazzjoni (Hamidi u Ivaska, 2018). It-tnaqqis tal-integrina medjat minn CRISPR/Cas9 inaqqas il-progressjoni tat-tumur, il-metastasi, u l-kolonizzazzjoni fit-TNBC. Ġie rrappurtat li t-tnaqqis tal-integrina a5 (ITGA5) inaqqas il-migrazzjoni u l-progressjoni taċ-ċelloli f'kanċers oħra bħall-kanċer tal-pulmun (Ju et al., 2017), li jissuġġerixxi li l-integrina a5 tista' tkun ukoll fattur ewlieni fil-patoġenesi tat-TNBC.
Il-ġenerazzjoni ta' ġrieden knockout bl-użu ta' metodi tradizzjonali ta' ċelluli staminali embrijoniċi (ES) hija proċess li jieħu ħafna xogħol, jieħu ħafna ħin, u huwa ineffiċjenti. Jieħu xhur u snin biex jiġu mmirati ċ-ċelluli ES permezz ta' rikombinazzjoni omologa, jitnisslu ġrieden kimeriċi, u mbagħad jitħalltu ma' ġrieden eterożigoti biex jiġu prodotti nisel omożigoti. Tgħammir kumpless huwa meħtieġ biex jinħolqu ġrieden b'mutazzjonijiet ġenetiċi multipli. Madankollu, inqalgħu ħafna problemi meta ntużaw ġrieden iġġenerati permezz ta' ablazzjoni taċ-ċelluli ES bl-użu ta' CRISPR/Cas9 jew billi jiġu mikroinjettati komponenti CRISPR/Cas9 f'bajd fertilizzat ta' ċellula waħda. Pereżempju, l-introduzzjoni ta' bidliet spiss isseħħ f'loċi bialleliċi u mhijiex speċifika għall-ġene. Riċentement ġie rrappurtat li ċ-ċelluli ES bl-użu tat-teknoloġija CRISPR/Cas9 jistgħu jdaħħlu simultanjament mutazzjonijiet bialleliċi f'sa 5 ġeni (Nishizono et al., 2021). Għal dan il-għan, l-mRNA Cas9 u ħames gRNAs speċifiċi għall-ġene ġew trasfettati simultanjament f'ċelluli ES. Dan jenfasizza l-wegħda u l-effettività ta’ din il-proċedura, għalkemm dawn il-mutazzjonijiet setgħu ġew mgħoddija meta linji fundaturi ġew imrobbija biex jipproduċu ġrieden kwintupli knockout. L-istudju jirrapporta wkoll skoperta sorprendenti: iċ-ċelloli ES m’għadhomx meħtieġa biex jinħolqu ġrieden ġenetikament modifikati. Minflok, biex jitneħħew prodotti ġenetiċi speċifiċi, l-mRNA Cas9 u l-gRNA ġew injettati f’embrijuni fi stadju ta’ ċellula waħda. B’riżultat ta’ dan, inħolqu linji fundaturi knockout li teoretikament jistgħu jintużaw biex jistudjaw il-konsegwenzi tat-tħassir tal-ġeni fil-ġrieden (Qin et al., 2016). Għalhekk, CRISPR/Cas9 jippermetti l-ħolqien ta’ ġrieden transġeniċi biex jikkuraw it-TNBC bi prezz aktar baxx mill-inġinerija ġenetika tradizzjonali. Bl-użu tas-sistema CRISPR/Cas, ġie żviluppat mudell ġdid ta’ ġrieden knockout li jista’ jintroduċi b’suċċess mutazzjonijiet puntwali f’ġene endoġenu wieħed jew aktar fit-TNBC. Abbażi ta' dan il-kunċett, mudelli tal-annimali ta' TNBC jistgħu jiġu żviluppati wkoll bl-użu tat-tħassir ta' BRCA1 u p53 medjat minn CRISPR/Cas9, li jirriżulta f'telf ta' tiswija HR, instabbiltà ġenomika, u fenotipi mutanti (Annunziato et al., 2020).
Bħalissa, diversi metodi bħall-mammografija, l-immaġini bir-reżonanza manjetika (MRI) u l-ultrasound jintużaw biex jiġi djanjostikat it-TNBC. Madankollu, dawn il-metodi għandhom xi limitazzjonijiet. Il-mammografija tintuża biex tiġi djanjostikata t-tessut tas-sider lokali aktar milli l-metastasi, fejn iċ-ċelloli tal-kanċer ikunu emigraw lejn organi oħra. L-ultrasoundografija mhijiex metodu affidabbli għad-dijanjosi tat-TNBC (Chen u Lee-Felker, 2023). L-MRI għandha sensittività ogħla mill-ultrasound u l-mammografija, iżda l-eżattezza dijanjostika tagħha hija limitata (Sha u Chen, 2022). Il-bijopsija tat-tessut hija mod invażiv biex jiġu identifikati ċ-ċelloli tal-kanċer. Madankollu, f'xi każijiet, bijopsija tista' titlef tessut kanċeruż jekk il-labra titbiegħed miż-żona ta' interess. Barra minn hekk, hija għalja ħafna u tista' tkun trawmatika għall-pazjent. It-TNBC huwa tip eteroġenju ta' kanċer, għalhekk bijopsija tista' ma tipprovdix biżżejjed informazzjoni dwar it-tip ta' kanċer. Għalhekk, hemm bżonn urġenti ta' metodu ġdid dijanjostikament affidabbli għall-iskoperta tat-TNBC. CRISPR/Cas9 jista' jservi bħala alternattiva sensittiva ħafna u minimament invażiva għad-dijanjosi tal-kanċer tas-sider. Għal dan il-għan, strateġiji bbażati fuq CRISPR/Cas9 jistgħu jintużaw biex itejbu l-metodi tal-PCR għad-dijanjosi ta' TNBC. L-ewwel, il-proteini Cas9 u cpf1 tas-sistema CRISPR jintużaw biex ineħħu d-DNA mhux speċifiku, u mbagħad dawn iż-żewġ proteini (Cas9 u cpf1) jistgħu jagħrfu s-sekwenza PAM qabel ma jorbtu mad-DNA fil-mira (Deepak Singh et al., 2021). Għalhekk, il-PCR jista' jidentifika mutazzjonijiet assoċjati mal-iżvilupp tal-kanċer. Diversi studji adottaw din l-istrateġija bbażata fuq CRISPR biex jidentifikaw mutazzjonijiet differenti f'kanċers differenti (Safari et al., 2019). Għalhekk, il-metodi tal-PCR ibbażati fuq CRISPR jistgħu jnaqqsu d-dipendenza tad-dijanjosi ta' TNBC fuq metodi invażivi bħall-immunoistokimika bbażata fuq il-bijopsija.
Bidliet ġenotipiċi fir-regolazzjoni tar-riċetturi tal-ormoni ġew murija wkoll fit-TNBC (Chen u Russo, 2009). Strateġiji PCR ibbażati fuq CRISPR/Cas9 li jużaw microarrays għal dijanjostika fil-punt tal-kura jistgħu jimmonitorjaw b'mod effettiv dawn il-mutazzjonijiet (Hajian et al., 2019). Jista' wkoll jipprovdi lill-fornituri tal-kura tas-saħħa b'informazzjoni rilevanti dwar mutazzjonijiet speċifiċi f'pazjenti TNBC, li jistgħu jgħinu biex itejbu l-kors tat-trattament tagħhom. Madankollu, din it-teknika kkombinata għandha limitazzjonijiet. Għalhekk, huma meħtieġa sforzi estensivi ta' riċerka qabel ma dan il-metodu CRISPR/Cas-PCR ikun jista' jintuża fil-kura tas-saħħa għad-dijanjosi ta' TNBC (Yang et al., 2019).