Id-dijanjosi differenzjali tan-noduli pulmonari identifikati bit-tomografija kompjuterizzata (CT) tibqa' sfida fil-prattika klinika.Hawnhekk, aħna nikkaratterizzaw il-metaboloma globali ta '480 kampjun tas-serum, inklużi kontrolli b'saħħithom, noduli tal-pulmun beninni, u adenokarċinoma tal-pulmun tal-istadju I.L-adenokarċinomi juru profili metabolomiċi uniċi, filwaqt li noduli beninni u individwi b'saħħithom għandhom xebh għoli fil-profili metabolomiċi.Fil-grupp ta 'skoperta (n = 306), sett ta' 27 metabolit ġie identifikat biex jiddifferenzja bejn noduli beninni u malinni.L-AUC tal-mudell diskriminanti fil-gruppi ta' validazzjoni interna (n = 104) u validazzjoni esterna (n = 111) kienet 0.915 u 0.945, rispettivament.L-analiżi tal-mogħdija żvelat metaboliti glycolytic miżjuda assoċjati ma 'tnaqqis ta' triptofan fis-serum tal-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbel ma 'noduli beninni u kontrolli b'saħħithom, u ssuġġeriet li l-assorbiment ta' triptofan jippromwovi l-glikolisi fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun.L-istudju tagħna jenfasizza l-valur tal-bijomarkaturi tal-metaboliti tas-serum fil-valutazzjoni tar-riskju ta 'noduli pulmonari misjuba minn CT.
Id-dijanjosi bikrija hija kritika biex ittejjeb ir-rati ta' sopravivenza għal pazjenti bil-kanċer.Riżultati mill-Prova Nazzjonali tal-Iscreening tal-Kanċer tal-pulmun tal-Istati Uniti (NLST) u l-Istudju Ewropew NELSON wrew li l-iskrinjar b'tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa (LDCT) jista' jnaqqas b'mod sinifikanti l-mortalità tal-kanċer tal-pulmun fi gruppi ta' riskju għoli1,2,3.Peress li l-użu mifrux ta 'LDCT għall-iskrining tal-kanċer tal-pulmun, l-inċidenza ta' sejbiet radjografiċi inċidentali ta 'noduli pulmonari bla sintomi kompliet tiżdied 4 .Noduli pulmonari huma definiti bħala opaċitajiet fokali sa 3 ċm fid-dijametru 5 .Aħna niffaċċjaw diffikultajiet biex nevalwaw il-probabbiltà ta 'tumuri malinni u nittrattaw in-numru kbir ta' noduli pulmonari misjuba inċidentalment fuq LDCT.Limitazzjonijiet ta 'CT jistgħu jwasslu għal eżamijiet ta' segwitu frekwenti u riżultati pożittivi foloz, li jwasslu għal intervent mhux meħtieġ u trattament żejjed6.Għalhekk, hemm bżonn li jiġu żviluppati bijomarkaturi affidabbli u utli biex jidentifikaw b'mod korrett il-kanċer tal-pulmun fl-istadji bikrija u jiddifferenzjaw il-biċċa l-kbira tan-noduli beninni fl-iskoperta inizjali 7 .
Analiżi molekulari komprensiva tad-demm (serum, plażma, ċelluli mononukleari tad-demm periferali), inklużi l-ġenomika, il-proteomika jew il-metilazzjoni tad-DNA8,9,10, wasslet għal interess dejjem jikber fl-iskoperta ta 'bijomarkaturi dijanjostiċi għall-kanċer tal-pulmun.Sadanittant, l-approċċi tal-metabolomika jkejlu prodotti finali ċellulari li huma influwenzati minn azzjonijiet endoġeni u eżoġeni u għalhekk huma applikati biex ibassru l-bidu u r-riżultat tal-mard.L-ispettrometrija tal-massa tal-kromatografija likwida-tandem (LC-MS) hija metodu użat ħafna għal studji tal-metabolomika minħabba s-sensittività għolja u l-firxa dinamika kbira tagħha, li tista 'tkopri metaboliti bi proprjetajiet fiżikokimiċi differenti11,12,13.Għalkemm l-analiżi metabolomika globali tal-plażma/serum intużat biex tidentifika bijomarkaturi assoċjati mad-dijanjosi tal-kanċer tal-pulmun14,15,16,17 u l-effikaċja tat-trattament, 18 klassifikaturi tal-metaboliti tas-serum biex jiddistingwu bejn noduli tal-pulmun beninni u malinni għad iridu jiġu studjati ħafna.-riċerka massiva.
L-adenokarċinoma u l-karċinoma taċ-ċelluli skwamużi huma ż-żewġ sottotipi ewlenin ta 'kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC).Diversi testijiet ta 'screening CT jindikaw li l-adenokarċinoma hija l-aktar tip istoloġiku komuni ta' kanċer tal-pulmun1,19,20,21.F'dan l-istudju, użajna kromatografija likwida ta 'prestazzjoni ultra-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS) biex twettaq analiżi tal-metabolomika fuq total ta' 695 kampjun tas-serum, inklużi kontrolli b'saħħithom, noduli pulmonari beninni, u CT-skoperti ≤3 ċm.Screening għall-adenokarċinoma tal-pulmun Stadju I.Aħna identifikajna panel ta 'metaboliti tas-serum li jiddistingwu l-adenokarċinoma tal-pulmun minn noduli beninni u kontrolli b'saħħithom.L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija wriet li l-metaboliżmu anormali tat-triptofan u tal-glukożju huma alterazzjonijiet komuni fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma 'noduli beninni u kontrolli b'saħħithom.Fl-aħħarnett, waqqafna u vvalidajna klassifikatur metaboliku tas-serum b'ispeċifiċità u sensittività għolja biex niddistingwu bejn noduli pulmonari malinni u beninni misjuba minn LDCT, li jistgħu jgħinu fid-dijanjosi differenzjali bikrija u l-valutazzjoni tar-riskju.
Fl-istudju attwali, kampjuni tas-serum imqabbla skond is-sess u l-età nġabru retrospettivament minn 174 kontroll b'saħħtu, 292 pazjent b'noduli pulmonari beninni, u 229 pazjent b'adenokarċinoma tal-pulmun stadju I.Il-karatteristiċi demografiċi tas-695 suġġett huma murija fit-Tabella Supplimentari 1.
Kif muri fil-Figura 1a, total ta '480 kampjun tas-serum, inklużi 174 kontroll b'saħħtu (HC), 170 nodulu beninni (BN), u 136 kampjun ta' adenokarċinoma tal-pulmun (LA) stadju I, inġabru fiċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università ta 'Sun Yat-sen.Koorti ta 'skoperta għal profili metabolomiċi mhux immirati bl-użu ta' kromatografija likwida ta 'prestazzjoni ultra-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS).Kif muri fil-Figura Supplimentari 1, metaboliti differenzjali bejn LA u HC, LA u BN ġew identifikati biex jistabbilixxu mudell ta 'klassifikazzjoni u jesploraw aktar analiżi tal-mogħdija differenzjali.104 kampjun miġbura minn Sun Yat-sen University Cancer Center u 111 kampjun miġbura minn żewġ sptarijiet oħra ġew soġġetti għal validazzjoni interna u esterna, rispettivament.
a Popolazzjoni ta 'studju fil-koorti ta' skoperta li għaddiet minn analiżi globali tal-metabolomika tas-serum bl-użu ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS).b Analiżi diskriminanti parzjali tal-inqas kwadri (PLS-DA) tal-metaboloma totali ta’ 480 kampjun tas-serum mill-koorti tal-istudju, inklużi kontrolli b’saħħithom (HC, n = 174), noduli beninni (BN, n = 170), u adenokarċinoma tal-pulmun tal-istadju I (Los Angeles, n = 136).+ ESI, mod ta 'jonizzazzjoni ta' elettrospray pożittiv, -ESI, modalità ta 'jonizzazzjoni ta' elettrospray negattiv.c–e Metaboliti b'abbundenzi differenti b'mod sinifikanti f'żewġ gruppi mogħtija (test tal-grad ffirmat ta' Wilcoxon b'żewġ denbu, valur p aġġustat tar-rata ta 'skoperta falza, FDR <0.05) huma murija bl-aħmar (bidla darbiet > 1.2) u blu (bidla darbiet < 0.83) .) murija fuq il-grafika tal-vulkan.f Mappa tas-sħana ta 'raggruppament ġerarkiku li turi differenzi sinifikanti fin-numru ta' metaboliti annotati bejn LA u BN.Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta’ fajls tad-dejta tas-sors.
Il-metaboloma totali tas-serum ta '174 HC, 170 BN u 136 LA fil-grupp ta' skoperta ġie analizzat bl-użu ta 'analiżi UPLC-HRMS.L-ewwel nuru li l-kampjuni tal-kontroll tal-kwalità (QC) jiġbru sewwa fiċ-ċentru ta 'mudell ta' analiżi tal-komponent prinċipali (PCA) mhux sorveljat, li jikkonferma l-istabbiltà tal-prestazzjoni tal-istudju kurrenti (Figura 2 Supplimentari).
Kif muri fl-analiżi parzjali tal-inqas kwadri-diskriminanti (PLS-DA) fil-Figura 1 b, sibna li kien hemm differenzi ċari bejn LA u BN, LA u HC fil-modi ta 'jonizzazzjoni tal-elettrospray pożittivi (+ESI) u negattivi (-ESI). .iżolati.Madankollu, ma nstabu l-ebda differenzi sinifikanti bejn BN u HC f'kundizzjonijiet + ESI u -ESI.
Sibna 382 karatteristika differenzjali bejn LA u HC, 231 karatteristika differenzjali bejn LA u BN, u 95 karatteristika differenzjali bejn BN u HC (Wilcoxon iffirmat rank test, FDR <0.05 u bidla multipla> 1.2 jew <0.83) (Figura .1c-e )..Il-qċaċet ġew annotati aktar (Data Supplimentari 3) kontra database (librerija mzCloud/HMDB/Chemspider) bil-valur m/z, ħin ta 'żamma u tfittxija tal-ispettru tal-massa tal-frammentazzjoni (dettalji deskritti fit-taqsima Metodi) 22 .Fl-aħħarnett, 33 u 38 metaboliti annotati b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza ġew identifikati għal LA versus BN (Figura 1f u Tabella Supplimentari 2) u LA kontra HC (Figura Supplimentari 3 u Tabella Supplimentari 2), rispettivament.B'kuntrast, 3 metaboliti biss b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza ġew identifikati f'BN u HC (Tabella Supplimentari 2), konsistenti mal-koinċidenza bejn BN u HC f'PLS-DA.Dawn il-metaboliti differenzjali jkopru firxa wiesgħa ta 'bijokimiċi (Figura 4 Supplimentari).Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati juru bidliet sinifikanti fil-metaboloma tas-serum li jirriflettu trasformazzjoni malinna ta 'kanċer tal-pulmun fi stadju bikri meta mqabbel ma' noduli tal-pulmun beninni jew suġġetti b'saħħithom.Sadanittant, ix-xebh tal-metaboloma tas-serum ta 'BN u HC jissuġġerixxi li noduli pulmonari beninni jistgħu jaqsmu ħafna karatteristiċi bijoloġiċi ma' individwi b'saħħithom.Minħabba li mutazzjonijiet tal-ġeni tar-riċettur tal-fattur tat-tkabbir epidermali (EGFR) huma komuni fis-sottotip 23 tal-adenokarċinoma tal-pulmun, fittxejna niddeterminaw l-impatt tal-mutazzjonijiet tas-sewwieq fuq il-metaboloma tas-serum.Imbagħad analizzajna l-profil metabolomiku ġenerali ta '72 każ bi status EGFR fil-grupp ta' adenokarċinoma tal-pulmun.Interessanti, sibna profili komparabbli bejn pazjenti mutanti EGFR (n = 41) u pazjenti EGFR wild-type (n = 31) fl-analiżi PCA (Figura Supplimentari 5a).Madankollu, identifikajna 7 metaboliti li l-abbundanza tagħhom ġiet mibdula b'mod sinifikanti f'pazjenti b'mutazzjoni EGFR meta mqabbla ma 'pazjenti b'EGFR tat-tip selvaġġ (test t, p <0.05 u bidla darbiet> 1.2 jew <0.83) (Figura Supplimentari 5b).Il-maġġoranza ta 'dawn il-metaboliti (5 minn 7) huma acylcarnitines, li għandhom rwol importanti fil-mogħdijiet ta' ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi.
Kif muri fil-fluss tax-xogħol muri fil-Figura 2 a, il-bijomarkaturi għall-klassifikazzjoni tan-noduli nkisbu bl-użu ta 'operaturi ta' tnaqqis assolut u għażla bbażata fuq 33 metaboliti differenzjali identifikati f'LA (n = 136) u BN (n = 170).L-aħjar kombinazzjoni ta 'varjabbli (LASSO) - mudell ta' rigressjoni loġistika binarja.Intużat cross-validation b'għaxar darbiet biex tiġi ttestjata l-affidabbiltà tal-mudell.L-għażla varjabbli u r-regolarizzazzjoni tal-parametri huma aġġustati b'penali għall-massimizzazzjoni tal-probabbiltà bil-parametru λ24.L-analiżi tal-metabolomika globali saret aktar b'mod indipendenti fil-gruppi ta 'validazzjoni interna (n = 104) u validazzjoni esterna (n = 111) biex tittestja l-prestazzjoni tal-klassifikazzjoni tal-mudell diskriminanti.Bħala riżultat, 27 metaboliti fis-sett ta 'skoperta ġew identifikati bħala l-aħjar mudell diskriminanti bl-akbar valur medju ta' AUC (Fig. 2b), li fosthom 9 kellhom attività miżjuda u 18 tnaqqis fl-attività f'LA meta mqabbla ma 'BN (Fig. 2c).
Fluss ta 'xogħol għall-bini ta' klassifikatur tan-noduli pulmonari, inkluż l-għażla tal-aħjar panel ta 'metaboliti tas-serum fis-sett ta' skoperta bl-użu ta 'mudell ta' rigressjoni loġistika binarja permezz ta 'validazzjoni inkroċjata ta' għaxar darbiet u l-evalwazzjoni tal-prestazzjoni ta 'tbassir f'settijiet ta' validazzjoni interni u esterni.b Statistika ta' validazzjoni inkroċjata tal-mudell ta' rigressjoni LASSO għall-għażla tal-bijomarkatur metaboliku.In-numri mogħtija hawn fuq jirrappreżentaw in-numru medju ta 'bijomarkaturi magħżula f'λ partikolari.Il-linja bit-tikek ħamra tirrappreżenta l-valur AUC medju fil-lambda korrispondenti.Il-vireg ta' żball griżi jirrappreżentaw il-valuri AUC minimi u massimi.Il-linja bit-tikek tindika l-aħjar mudell bis-27 bijomarkatur magħżula.AUC, żona taħt il-kurva tal-karatteristika operattiva tar-riċevitur (ROC).c Titwi bidliet ta '27 metaboliti magħżula fil-grupp LA meta mqabbla mal-grupp BN fil-grupp ta' skoperta.Kolonna ħamra – attivazzjoni.Il-kolonna blu hija tnaqqis.d–f Kurvi tal-karatteristiċi operattivi tar-riċevitur (ROC) li juru l-qawwa tal-mudell diskriminanti bbażat fuq 27 kombinazzjoni ta' metaboliti fis-settijiet ta' validazzjoni ta' skoperta, interni u esterni.Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta’ fajls tad-dejta tas-sors.
Inħoloq mudell ta 'tbassir ibbażat fuq il-koeffiċjenti ta' rigressjoni peżati ta 'dawn is-27 metabolit (Tabella Supplimentari 3).L-analiżi ROC ibbażata fuq dawn is-27 metaboliti tat żona taħt il-valur tal-kurva (AUC) ta '0.933, is-sensittività tal-grupp ta' skoperta kienet 0.868, u l-ispeċifiċità kienet 0.859 (Fig. 2d).Sadanittant, fost it-38 metaboliti differenzjali annotati bejn LA u HC, sett ta '16-il metabolit kiseb AUC ta' 0.902 b'sensittività ta '0.801 u speċifiċità ta' 0.856 fid-diskriminazzjoni LA minn HC (Figura Supplimentari 6a-c).Tqabblu wkoll il-valuri tal-AUC ibbażati fuq limiti ta' tibdil ta' darbiet differenti għal metaboliti differenzjali.Sibna li l-mudell ta 'klassifikazzjoni wettaq l-aħjar fid-diskriminazzjoni bejn LA u BN (HC) meta l-livell ta' bidla ta 'tinja kien issettjat għal 1.2 kontra 1.5 jew 2.0 (Figura Supplimentari 7a, b).Il-mudell ta' klassifikazzjoni, ibbażat fuq 27 grupp ta' metaboliti, ġie vvalidat aktar f'koorti interni u esterni.L-AUC kien 0.915 (sensittività 0.867, speċifiċità 0.811) għal validazzjoni interna u 0.945 (sensittività 0.810, speċifiċità 0.979) għal validazzjoni esterna (Fig. 2e, f).Biex tiġi vvalutata l-effiċjenza interlaboratorju, ġew analizzati 40 kampjun mill-koorti esterna f'laboratorju estern kif deskritt fit-taqsima Metodi.L-eżattezza tal-klassifikazzjoni kisbet AUC ta '0.925 (Figura Supplimentari 8).Minħabba li l-karċinoma taċ-ċelluli squamous tal-pulmun (LUSC) hija t-tieni sottotip l-aktar komuni ta 'kanċer tal-pulmun taċ-ċelluli mhux żgħar (NSCLC) wara l-adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), aħna ttestjajna wkoll l-utilità potenzjali validata tal-profili metaboliċi.BN u 16-il każ ta’ LUSC.L-AUC tad-diskriminazzjoni bejn LUSC u BN kienet 0.776 (Figura Supplimentari 9), li tindika kapaċità ifqar meta mqabbla mad-diskriminazzjoni bejn LUAD u BN.
Studji wrew li d-daqs tan-noduli fuq l-immaġini CT huwa korrelatat b'mod pożittiv mal-probabbiltà ta 'tumuri malinni u jibqa' determinant ewlieni tat-trattament tan-noduli25,26,27.Analiżi tad-dejta mill-koorti l-kbira tal-istudju ta' screening NELSON wriet li r-riskju ta' tumuri malinni f'suġġetti b'nodi <5 mm kien saħansitra simili għal dak f'suġġetti mingħajr nodi 28 .Għalhekk, id-daqs minimu li jeħtieġ monitoraġġ CT regolari huwa 5 mm, kif rakkomandat mill-British Thoracic Society (BTS), u 6 mm, kif rakkomandat mis-Soċjetà Fleischner 29 .Madankollu, noduli akbar minn 6 mm u mingħajr karatteristiċi beninni ovvji, imsejħa noduli pulmonari indeterminati (IPN), jibqgħu sfida kbira fl-evalwazzjoni u l-ġestjoni fil-prattika klinika30,31.Imbagħad eżaminajna jekk id-daqs tan-noduli influwenzax firem metabolomiċi bl-użu ta 'kampjuni miġbura mill-koorti ta' skoperta u validazzjoni interna.Ffoka fuq 27 bijomarkatur validati, l-ewwel qabbilna l-profili PCA ta 'metabolomi HC u BN sub-6 mm.Sibna li l-biċċa l-kbira tal-punti tad-dejta għal HC u BN kienu jikkoinċidu, u dan juri li l-livelli tal-metaboliti fis-serum kienu simili fiż-żewġ gruppi (Fig. 3a).Il-mapep tal-karatteristiċi f'firxiet ta 'daqs differenti baqgħu kkonservati f'BN u LA (Fig. 3b, c), filwaqt li ġiet osservata separazzjoni bejn noduli malinni u beninni fil-medda 6-20 mm (Fig. 3d).Din il-koorti kellha AUC ta '0.927, speċifiċità ta' 0.868, u sensittività ta '0.820 għat-tbassir tal-tumuri malinni ta' noduli li jkejlu 6 sa 20 mm (Fig. 3e, f).Ir-riżultati tagħna juru li l-klassifikatur jista 'jaqbad bidliet metaboliċi kkawżati minn trasformazzjoni malinna bikrija, irrispettivament mid-daqs tan-nodulu.
ad Tqabbil ta' profili PCA bejn gruppi speċifikati bbażati fuq klassifikatur metaboliku ta' 27 metabolit.CC u BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.f'LA 6–20 mm kontra LA 20–30 mm.g BN 6-20 mm u LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva tal-karatteristika operattiva tar-riċevitur (ROC) li turi prestazzjoni tal-mudell diskriminanti għal noduli 6–20 mm.f Il-valuri tal-probabbiltà ġew ikkalkulati abbażi tal-mudell ta 'rigressjoni loġistika għal noduli li jkejlu 6-20 mm.Il-linja bil-tikek griż tirrappreżenta l-aħjar valur tal-qtugħ (0.455).In-numri ta 'hawn fuq jirrappreżentaw il-perċentwal ta' każijiet ipproġettati għal Los Angeles.Uża test t tal-Istudent b'żewġ denbu.PCA, analiżi tal-komponent prinċipali.Erja AUC taħt il-kurva.Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta’ fajls tad-dejta tas-sors.
Erba 'kampjuni (ta' 44-61 sena) b'daqsijiet simili tan-nodulu pulmonari (7-9 mm) ġew magħżula aktar biex juru l-prestazzjoni tal-mudell ta 'tbassir malinn propost (Fig. 4a, b).Fuq screening inizjali, Każ 1 ippreżentat bħala nodulu solidu b'kalċifikazzjoni, karatteristika assoċjata mal-beninità, filwaqt li Każ 2 ippreżentat bħala nodulu parzjalment solidu indeterminat mingħajr karatteristiċi beninni ovvji.Tliet rawnds ta 'skans CT ta' segwitu wrew li dawn il-każijiet baqgħu stabbli fuq perjodu ta '4 snin u għalhekk kienu kkunsidrati noduli beninni (Fig. 4a).Meta mqabbel ma 'evalwazzjoni klinika ta' skans tas-serje CT, analiżi tal-metaboliti tas-serum b'shot wieħed mal-mudell ta 'klassifikatur attwali identifika malajr u b'mod korrett dawn in-noduli beninni bbażati fuq restrizzjonijiet probabilistiċi (Tabella 1).Il-Figura 4b fil-każ 3 turi nodulu b'sinjali ta 'retrazzjoni tal-plewra, li l-aktar spiss huwa assoċjat ma' malinn32.Każ 4 ippreżentat bħala nodulu parzjalment solidu indeterminat bl-ebda evidenza ta 'kawża beninna.Dawn il-każijiet kollha kienu mbassra bħala malinni skont il-mudell tal-klassifikatur (Tabella 1).Il-valutazzjoni tal-adenokarċinoma tal-pulmun intweriet b'eżami istopatoloġiku wara kirurġija ta 'resezzjoni tal-pulmun (Fig. 4b).Għas-sett ta 'validazzjoni esterna, il-klassifikatur metaboliku mbassar b'mod preċiż żewġ każijiet ta' noduli tal-pulmun indeterminati akbar minn 6 mm (Figura Supplimentari 10).
Immaġini CT tat-tieqa axjali tal-pulmuni ta 'żewġ każijiet ta' noduli beninni.Fil-każ 1, CT scan wara 4 snin wera nodulu solidu stabbli li jkejjel 7 mm b'kalċifikazzjoni fil-lobu t'isfel tal-lemin.Fil-każ 2, CT scan wara 5 snin żvela nodulu stabbli, parzjalment solidu b'dijametru ta '7 mm fil-lobu ta' fuq tal-lemin.b Immaġini CT tat-tieqa axjali tal-pulmun u studji patoloġiċi korrispondenti ta 'żewġ każijiet ta' adenokarċinoma ta 'stadju I qabel ir-resezzjoni tal-pulmun.Każ 3 żvela nodulu b'dijametru ta '8 mm fil-lobu ta' fuq tal-lemin b'retrazzjoni plewrali.Każ 4 żvela nodulu tal-ħġieġ mitħun parzjalment solidu li jkejjel 9 mm fil-lobu ta 'fuq tax-xellug.Tbajja ta 'ematossilina u eosina (H&E) ta' tessut tal-pulmun resected (scale bar = 50 μm) li turi l-mudell ta 'tkabbir acinar ta' adenokarċinoma tal-pulmun.Il-vleġeġ jindikaw noduli misjuba fuq immaġini CT.L-immaġini H&E huma stampi rappreżentattivi ta' oqsma mikroskopiċi multipli (>3) eżaminati mill-patologu.
Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna juru l-valur potenzjali tal-bijomarkaturi tal-metaboliti tas-serum fid-dijanjosi differenzjali tan-noduli pulmonari, li jistgħu joħolqu sfidi meta jevalwaw l-iskrining CT.
Ibbażat fuq panel metabolit differenzjali vvalidat, fittxejna li nidentifikaw korelati bijoloġiċi ta 'bidliet metaboliċi maġġuri.L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG minn MetaboAnalyst identifikat 6 mogħdijiet komuni mibdula b'mod sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi mogħtija (LA vs. HC u LA vs. BN, p aġġustat ≤ 0.001, effett > 0.01).Dawn il-bidliet kienu kkaratterizzati minn disturbi fil-metaboliżmu tal-pyruvate, metaboliżmu tat-triptofan, metaboliżmu ta 'niacin u nikotinamide, glikolisi, iċ-ċiklu TCA, u metaboliżmu tal-purini (Fig. 5a).Imbagħad wettaqna aktar metabolomika mmirata biex nivverifikaw bidliet kbar bl-użu ta 'kwantifikazzjoni assoluta.Determinazzjoni ta' metaboliti komuni f'mogħdijiet mibdula b'mod komuni permezz ta' spettrometrija tal-massa triple quadrupole (QQQ) bl-użu ta' standards ta' metaboliti awtentiċi.Karatteristiċi demografiċi tal-kampjun fil-mira tal-istudju tal-metabolomika huma inklużi fit-Tabella Supplimentari 4. B'mod konsistenti mar-riżultati tal-metabolomika globali tagħna, analiżi kwantitattiva kkonfermat li l-ipoxanthine u l-xanthine, il-pyruvate u l-lactate żdiedu f'LA meta mqabbla ma 'BN u HC (Fig. 5b, c, p <0.05).Madankollu, ma nstabet l-ebda differenzi sinifikanti f'dawn il-metaboliti bejn BN u HC.
Analiżi ta 'arrikkiment tal-mogħdija KEGG ta' metaboliti differenti b'mod sinifikanti fil-grupp LA meta mqabbla mal-gruppi BN u HC.Intuża Globaltest b'żewġ denbu, u l-valuri p ġew aġġustati bl-użu tal-metodu Holm-Bonferroni (p ≤ 0.001 aġġustat u daqs tal-effett > 0.01).b–d Plottijiet tal-vjolin li juru livelli ta' hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, u tryptophan fis-serum HC, BN, u LA determinati minn LC-MS/MS (n = 70 għal kull grupp).Linji bit-tikek bojod u suwed jindikaw il-medjan u l-kwartil, rispettivament.e Plott tal-vjolin li juri espressjoni ta' mRNA Log2TPM normalizzata (traskrizzjonijiet għal kull miljun) ta' SLC7A5 u QPRT f'adenokarċinoma tal-pulmun (n = 513) meta mqabbla ma' tessut normali tal-pulmun (n = 59) fid-dataset LUAD-TCGA.Il-kaxxa bajda tirrappreżenta l-firxa interkwartili, il-linja sewda orizzontali fiċ-ċentru tirrappreżenta l-medjan, u l-linja sewda vertikali li testendi mill-kaxxa tirrappreżenta l-intervall ta 'kunfidenza ta' 95% (CI).f Plott ta' korrelazzjoni ta' Pearson tal-espressjoni ta' SLC7A5 u GAPDH f'adenokarċinoma tal-pulmun (n = 513) u tessut normali tal-pulmun (n = 59) fid-dataset TCGA.Iż-żona griża tirrappreżenta l-95% CI.r, koeffiċjent ta 'korrelazzjoni Pearson.g Livelli ta' triptofan ċellulari normalizzati f'ċelluli A549 trasfettati b'kontroll shRNA mhux speċifiku (NC) u shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinati b'LC-MS/MS.Analiżi statistika ta 'ħames kampjuni bijoloġikament indipendenti f'kull grupp hija ppreżentata.h Livelli ċellulari ta 'NADt (NAD totali, inklużi NAD+ u NADH) fiċ-ċelloli A549 (NC) u ċelloli knockdown A549 SLC7A5 (Sh1, Sh2).Analiżi statistika ta 'tliet kampjuni bijoloġikament indipendenti f'kull grupp hija ppreżentata.i L-attività glikolitika taċ-ċelloli A549 qabel u wara l-knockdown ta' SLC7A5 ġiet imkejla permezz tar-rata ta' aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR) (n = 4 kampjuni bijoloġikament indipendenti għal kull grupp).2-DG,2-deoxy-D-glukosju.It-test t ta' Student b'żewġ denbu ntuża f'(b–h).F'(g–i), il-vireg ta 'żball jirrappreżentaw il-medja ± SD, kull esperiment sar tliet darbiet b'mod indipendenti u r-riżultati kienu simili.Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta’ fajls tad-dejta tas-sors.
Meta wieħed iqis l-impatt sinifikanti tal-metaboliżmu mibdul tat-triptofan fil-grupp LA, ivvalutajna wkoll il-livelli ta 'triptofan fis-serum fil-gruppi HC, BN, u LA bl-użu ta' QQQ.Sibna li t-triptofan fis-serum tnaqqas f'LA meta mqabbel ma' HC jew BN (p <0.001, Figura 5d), li huwa konsistenti ma' sejbiet preċedenti li l-livelli ta' triptofan li jiċċirkolaw huma aktar baxxi f'pazjenti b'kanċer tal-pulmun milli f'kontrolli b'saħħithom mill-grupp ta' kontroll33,34. ,35.Studju ieħor li juża PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan sab li l-ħin taż-żamma tas-sinjal tat-tryptophan fit-tessut tal-kanċer tal-pulmun żdied b'mod sinifikanti meta mqabbel ma 'leżjonijiet beninni jew tessut normali36.Aħna ipoteżi li t-tnaqqis fit-tryptophan fis-serum LA jista 'jirrifletti l-assorbiment attiv tat-tryptophan miċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun.
Huwa magħruf ukoll li l-prodott finali tal-mogħdija kynurenine tal-kataboliżmu tat-triptofan huwa NAD + 37,38, li huwa sottostrat importanti għar-reazzjoni ta 'glyceraldehyde-3-phosphate ma' 1,3-bisphosphoglycerate fil-glycolysis39.Filwaqt li studji preċedenti ffukaw fuq ir-rwol tal-kataboliżmu tat-triptofan fir-regolamentazzjoni immuni, fittxejna li niċċaraw l-interazzjoni bejn id-disregolazzjoni tat-triptofan u l-mogħdijiet glikolitiċi osservati fl-istudju attwali.Il-membru 5 tal-familja tat-trasportatur tas-soluti 7 (SLC7A5) huwa magħruf li huwa trasportatur tat-triptofan43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) hija enzima li tinsab 'l isfel mill-mogħdija tal-kynurenine li tikkonverti l-aċidu quinolinic għal NAMN46.L-ispezzjoni tas-sett tad-dejta LUAD TCGA wriet li kemm SLC7A5 kif ukoll QPRT kienu rregolati b'mod sinifikanti fit-tessut tat-tumur meta mqabbel mat-tessut normali (Fig. 5e).Din iż-żieda kienet osservata fl-istadji I u II kif ukoll fl-istadji III u IV tal-adenokarċinoma tal-pulmun (Figura Supplimentari 11), li tindika disturbi bikrija fil-metaboliżmu tat-triptofan assoċjati mat-tumuriġenesi.
Barra minn hekk, is-sett tad-dejta LUAD-TCGA wera korrelazzjoni pożittiva bejn l-espressjoni tal-mRNA SLC7A5 u GAPDH f'kampjuni ta 'pazjenti bil-kanċer (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figura 5f).B'kuntrast, ma nstabet l-ebda korrelazzjoni sinifikanti bejn tali firem tal-ġeni fit-tessut normali tal-pulmun (r = 0.25, p = 0.06, Figura 5f).Il-knockdown ta 'SLC7A5 (Figura Supplimentari 12) fiċ-ċelloli A549 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' triptofan ċellulari u NAD (H) (Figura 5g, h), li rriżulta f'attività glikolitika attenwata kif imkejla bir-rata ta 'aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR) (Figura 1).5i).Għalhekk, ibbażati fuq bidliet metaboliċi fis-serum u l-iskoperta in vitro, aħna ipoteżi li l-metaboliżmu tat-triptofan jista 'jipproduċi NAD + permezz tal-mogħdija tal-kynurenine u għandu rwol importanti fil-promozzjoni tal-glikolisi fil-kanċer tal-pulmun.
Studji wrew li numru kbir ta 'noduli pulmonari indeterminati misjuba minn LDCT jista' jwassal għall-ħtieġa għal testijiet addizzjonali bħal PET-CT, bijopsija tal-pulmun, u trattament żejjed minħabba dijanjosi pożittiva falza ta 'malinn.31 Kif muri fil-Figura 6, l-istudju tagħna identifika panel ta 'metaboliti tas-serum b'valur dijanjostiku potenzjali li jista' jtejjeb l-istratifikazzjoni tar-riskju u l-ġestjoni sussegwenti tan-noduli pulmonari misjuba minn CT.
In-noduli pulmonari huma evalwati bl-użu ta' tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa (LDCT) b'karatteristiċi ta' immaġini li jissuġġerixxu kawżi beninni jew malinni.Ir-riżultat inċert tan-noduli jista' jwassal għal żjarat ta' segwitu frekwenti, interventi mhux meħtieġa u trattament żejjed.L-inklużjoni ta' klassifikaturi metaboliċi fis-serum b'valur dijanjostiku tista' ttejjeb il-valutazzjoni tar-riskju u l-ġestjoni sussegwenti tan-noduli pulmonari.Tomografija ta' emissjoni ta' positroni tal-PET.
Dejta mill-istudju NLST tal-Istati Uniti u mill-istudju NELSON Ewropew jissuġġerixxu li l-iskrinjar ta' gruppi ta' riskju għoli b'tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa (LDCT) jista' jnaqqas il-mortalità mill-kanċer tal-pulmun1,3.Madankollu, il-valutazzjoni tar-riskju u l-ġestjoni klinika sussegwenti ta 'numri kbar ta' noduli pulmonari inċidentali misjuba minn LDCT jibqgħu l-aktar ta 'sfida.L-għan ewlieni huwa li tiġi ottimizzata l-klassifikazzjoni korretta ta 'protokolli eżistenti bbażati fuq LDCT billi jinkorporaw bijomarkaturi affidabbli.
Ċerti bijomarkaturi molekulari, bħall-metaboliti tad-demm, ġew identifikati billi tqabbel il-kanċer tal-pulmun ma 'kontrolli b'saħħithom15,17.Fl-istudju attwali, iffukajna fuq l-applikazzjoni tal-analiżi tal-metabolomika tas-serum biex niddistingwu bejn noduli pulmonari beninni u malinni misjuba inċidentalment minn LDCT.Aħna qabblu l-metaboloma globali tas-serum ta 'kontroll b'saħħtu (HC), noduli tal-pulmun beninni (BN), u kampjuni ta' adenokarċinoma tal-pulmun (LA) stadju I bl-użu ta 'analiżi UPLC-HRMS.Sibna li HC u BN kellhom profili metaboliċi simili, filwaqt li LA wriet bidliet sinifikanti meta mqabbla ma 'HC u BN.Aħna identifikajna żewġ settijiet ta 'metaboliti tas-serum li jiddifferenzjaw LA minn HC u BN.
L-iskema ta’ identifikazzjoni attwali bbażata fuq l-LDCT għal noduli beninni u malinni hija bbażata prinċipalment fuq id-daqs, id-densità, il-morfoloġija u r-rata ta’ tkabbir tan-noduli matul iż-żmien30.Studji preċedenti wrew li d-daqs tan-noduli huwa relatat mill-qrib mal-probabbiltà ta 'kanċer tal-pulmun.Anke f'pazjenti b'riskju għoli, ir-riskju ta 'tumuri malinni f'nodi <6 mm huwa <1%.Ir-riskju ta' tumuri malinni għal noduli li jkejlu minn 6 sa 20 mm ivarja minn 8% sa 64%30.Għalhekk, is-Soċjetà Fleischner tirrakkomanda dijametru ta' qtugħ ta' 6 mm għal segwitu ta' rutina CT.29 Madankollu, il-valutazzjoni tar-riskju u l-ġestjoni ta' noduli pulmonari indeterminati (IPN) akbar minn 6 mm ma twettqux b'mod adegwat 31 .Il-ġestjoni attwali tal-mard tal-qalb konġenitali hija ġeneralment ibbażata fuq stennija attenta b'monitoraġġ frekwenti CT.
Ibbażat fuq il-metaboloma validat, urejna għall-ewwel darba l-koinċidenza ta 'firem metabolomiċi bejn individwi b'saħħithom u noduli beninni <6 mm.Ix-xebh bijoloġiku huwa konsistenti mas-sejbiet preċedenti tas-CT li r-riskju ta’ tumuri malinni għal noduli <6 mm huwa baxx daqs għal suġġetti mingħajr noduli.30 Għandu jiġi nnutat li r-riżultati tagħna juru wkoll li n-noduli beninni <6 mm u ≥6 mm għandhom għolja. xebh fil-profili metabolomiċi, li jissuġġerixxi li d-definizzjoni funzjonali ta 'etjoloġija beninna hija konsistenti irrispettivament mid-daqs tan-nodulu.Għalhekk, pannelli dijanjostiċi moderni tal-metaboliti tas-serum jistgħu jipprovdu analiżi waħda bħala test ta' esklużjoni meta n-noduli jiġu inizjalment skoperti fuq CT u potenzjalment inaqqsu l-monitoraġġ tas-serje.Fl-istess ħin, l-istess panel ta 'bijomarkaturi metaboliċi ddistingwi noduli malinni ≥6 mm fid-daqs minn noduli beninni u pprovda tbassir preċiż għal IPNs ta' daqs simili u karatteristiċi morfoloġiċi ambigwi fuq immaġini CT.Dan il-klassifikatur tal-metaboliżmu fis-serum għamel tajjeb fit-tbassir tal-tumuri malinni tan-noduli ≥6 mm b'AUC ta' 0.927.Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jindikaw li firem metabolomiċi tas-serum uniċi jistgħu jirriflettu speċifikament bidliet metaboliċi bikrija indotti mit-tumur u għandhom valur potenzjali bħala tbassir tar-riskju, indipendenti mid-daqs tan-nodulu.
Notevolment, l-adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD) u l-karċinoma taċ-ċelluli squamous (LUSC) huma t-tipi ewlenin ta 'kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC).Minħabba li LUSC hija assoċjata b'mod qawwi mal-użu tat-tabakk47 u LUAD hija l-istoloġija l-aktar komuni ta 'noduli tal-pulmun inċidentali misjuba fuq screening CT48, il-mudell ta' klassifikatur tagħna nbena speċifikament għal kampjuni ta 'adenokarċinoma ta' stadju I.Wang u l-kollegi ffukaw ukoll fuq LUAD u identifikaw disa 'firem tal-lipidi bl-użu ta' lipidomics biex jiddistingwu l-kanċer tal-pulmun fi stadju bikri minn individwi b'saħħithom17.Aħna ttestjajna l-mudell tal-klassifikatur attwali fuq 16-il każ ta 'stadju I LUSC u 74 nodulu beninni u osservajna preċiżjoni baxxa ta' tbassir LUSC (AUC 0.776), li tissuġġerixxi li LUAD u LUSC jista 'jkollhom il-firem metabolomiċi tagħhom stess.Tabilħaqq, LUAD u LUSC intwerew li huma differenti fl-etjoloġija, l-oriġini bijoloġika u l-aberrazzjonijiet ġenetiċi49.Għalhekk, tipi oħra ta 'istoloġija għandhom jiġu inklużi f'mudelli ta' taħriġ għall-iskoperta bbażata fuq il-popolazzjoni tal-kanċer tal-pulmun fi programmi ta 'screening.
Hawnhekk, identifikajna s-sitt mogħdijiet mibdula l-aktar frekwenti fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma 'kontrolli b'saħħithom u noduli beninni.Xanthine u hypoxanthine huma metaboliti komuni tal-mogħdija metabolika tal-purina.B'mod konsistenti mar-riżultati tagħna, intermedji assoċjati mal-metaboliżmu tal-purini żdiedu b'mod sinifikanti fis-serum jew fit-tessuti ta 'pazjenti b'adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom jew pazjenti fl-istadju preinvażiv15,50.Livelli elevati ta' xanthine u hypoxanthine fis-serum jistgħu jirriflettu l-anaboliżmu meħtieġ minn ċelluli tal-kanċer li qed jipproliferaw malajr.Id-disregolazzjoni tal-metaboliżmu tal-glukożju hija karatteristika magħrufa sew tal-metaboliżmu tal-kanċer51.Hawnhekk, osservajna żieda sinifikanti fil-pyruvate u l-lactate fil-grupp LA meta mqabbel mal-grupp HC u BN, li hija konsistenti ma 'rapporti preċedenti ta' anormalitajiet fil-passaġġi glikolitiċi fil-profili tal-metaboloma tas-serum ta 'pazjenti b'kanċer tal-pulmun taċ-ċelluli mhux żgħar (NSCLC) u kontrolli b'saħħithom.ir-riżultati huma konsistenti52,53.
Importanti, osservajna korrelazzjoni inversa bejn il-piruvat u l-metaboliżmu tat-triptofan fis-serum tal-adenokarċinomi tal-pulmun.Il-livelli ta' triptofan fis-serum tnaqqsu fil-grupp LA meta mqabbla mal-grupp HC jew BN.Interessanti, studju preċedenti fuq skala kbira li juża koorti prospettiva sab li livelli baxxi ta 'triptofan li jiċċirkola kienu assoċjati ma' riskju akbar ta 'kanċer tal-pulmun 54 .Tryptophan huwa aċidu amminiku essenzjali li nġibu kompletament mill-ikel.Aħna nikkonkludu li t-tnaqqis tat-triptofan fis-serum fl-adenokarċinoma tal-pulmun jista 'jirrifletti t-tnaqqis rapidu ta' dan il-metabolit.Huwa magħruf sew li l-prodott finali tal-kataboliżmu tat-triptofan permezz tal-mogħdija tal-kynurenine huwa s-sors tas-sintesi de novo NAD+.Minħabba li NAD+ jiġi prodott primarjament permezz tal-mogħdija tas-salvataġġ, l-importanza tan-NAD+ fil-metaboliżmu tat-triptofan fis-saħħa u l-mard għad trid tiġi determinata46.L-analiżi tagħna tad-database TCGA wriet li l-espressjoni tat-trasportatur tas-solute tat-trasportatur tat-tryptophan 7A5 (SLC7A5) żdiedet b'mod sinifikanti fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma 'kontrolli normali u kienet korrelatata b'mod pożittiv mal-espressjoni tal-enzima glycolytic GAPDH.Studji preċedenti ffukaw prinċipalment fuq ir-rwol tal-kataboliżmu tat-triptofan fit-trażżin tar-rispons immuni kontra t-tumur40,41,42.Hawnhekk aħna nuru li l-inibizzjoni tal-assorbiment ta 'triptofan permezz ta' knockdown ta 'SLC7A5 fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun jirriżulta fi tnaqqis sussegwenti fil-livelli ċellulari ta' NAD u attenwazzjoni konkomitanti tal-attività glikolitika.Fil-qosor, l-istudju tagħna jipprovdi bażi bijoloġika għal bidliet fil-metaboliżmu tas-serum assoċjati ma 'trasformazzjoni malinna ta' adenokarċinoma tal-pulmun.
Mutazzjonijiet EGFR huma l-aktar mutazzjonijiet ta' sewwieq komuni f'pazjenti b'NSCLC.Fl-istudju tagħna, sibna li pazjenti b'mutazzjoni EGFR (n = 41) kellhom profili metabolomiċi ġenerali simili għal pazjenti b'EGFR tat-tip selvaġġ (n = 31), għalkemm sibna livelli mnaqqsa fis-serum ta 'xi pazjenti mutanti EGFR f'pazjenti acylcarnitine.Il-funzjoni stabbilita ta 'acylcarnitines hija li tittrasporta gruppi ta' acyl miċ-ċitoplasma fil-matriċi mitokondrijali, li twassal għall-ossidazzjoni ta 'aċidi grassi biex jipproduċu l-enerġija 55 .B'mod konsistenti mas-sejbiet tagħna, studju reċenti identifika wkoll profili ta 'metaboloma simili bejn tumuri tat-tip selvaġġ ta' EGFR mutant u EGFR billi janalizza l-metaboloma globali ta '102 kampjuni ta' tessut tal-adenokarċinoma tal-pulmun50.Interessanti, il-kontenut ta 'acylcarnitine instab ukoll fil-grupp ta' mutanti EGFR.Għalhekk, jekk il-bidliet fil-livelli ta 'acylcarnitine jirriflettux bidliet metaboliċi indotti mill-EGFR u l-mogħdijiet molekulari sottostanti jistgħu jistħoqqilhom aktar studju.
Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna jistabbilixxi klassifikatur metaboliku tas-serum għad-dijanjosi differenzjali ta 'noduli pulmonari u jipproponi fluss tax-xogħol li jista' jottimizza l-valutazzjoni tar-riskju u jiffaċilita l-ġestjoni klinika bbażata fuq screening CT scan.
Dan l-istudju ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Isptar tal-Kanċer tal-Università ta 'Sun Yat-sen, l-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università ta' Sun Yat-sen, u l-Kumitat tal-Etika tal-Isptar tal-Kanċer tal-Università ta 'Zhengzhou.Fil-gruppi ta 'skoperta u validazzjoni interna, inġabru 174 serum minn individwi b'saħħithom u 244 serum minn noduli beninni minn individwi li kienu għaddejjin minn eżamijiet mediċi annwali fid-Dipartiment tal-Kontroll u l-Prevenzjoni tal-Kanċer, Sun Yat-sen University Cancer Center, u 166 nodulu beninni.serum.Stadju I adenokarċinomi tal-pulmun inġabru miċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università ta 'Sun Yat-sen.Fil-koorti ta 'validazzjoni esterna, kien hemm 48 każ ta' noduli beninni, 39 każ ta 'adenokarċinoma tal-pulmun ta' stadju I mill-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università ta 'Sun Yat-sen, u 24 każ ta' adenokarċinoma tal-pulmun ta 'stadju I mill-Isptar tal-Kanċer ta' Zhengzhou.Iċ-Ċentru tal-Kanċer ta 'l-Università ta' Sun Yat-sen ġabar ukoll 16-il każ ta 'kanċer tal-pulmun taċ-ċelluli squamous ta' stadju I biex jittestja l-kapaċità dijanjostika tal-klassifikatur metaboliku stabbilit (il-karatteristiċi tal-pazjent huma murija fit-Tabella Supplimentari 5).Inġabru kampjuni mill-koorti tal-iskoperta u mill-koorti tal-validazzjoni interna bejn Jannar 2018 u Mejju 2020. Inġabru kampjuni mill-koorti tal-validazzjoni esterna bejn Awwissu 2021 u Ottubru 2022. Biex jiġi minimizzat il-preġudizzju tal-ġeneru, ġew assenjati għadd bejn wieħed u ieħor indaqs ta’ każijiet irġiel u nisa għal kull wieħed. koorti.Skoperta Team u Internal Review Team.Is-sess tal-parteċipant ġie ddeterminat abbażi ta’ awto-rapport.Inkiseb kunsens infurmat mill-parteċipanti kollha u ma ngħata l-ebda kumpens.Suġġetti b'noduli beninni kienu dawk b'punteġġ stabbli ta 'CT scan bejn 2 u 5 snin fil-ħin tal-analiżi, ħlief għal każ 1 mill-kampjun ta' validazzjoni esterna, li nġabar qabel l-operazzjoni u djanjostikat mill-istopatoloġija.Bl-eċċezzjoni tal-bronkite kronika.Każijiet ta' adenokarċinoma tal-pulmun inġabru qabel ir-resezzjoni tal-pulmun u kkonfermati b'dijanjosi patoloġika.Inġabru kampjuni tad-demm waqt is-sawm f’tubi ta’ separazzjoni tas-serum mingħajr ebda antikoagulanti.Kampjuni tad-demm ġew magħquda għal siegħa f'temperatura tal-kamra u mbagħad ċentrifugati f'2851 × g għal 10 minuti f'4 ° C biex jiġbru s-supernatant tas-serum.L-alikwoti tas-serum ġew iffriżati f'-80°C sal-estrazzjoni tal-metabolit.Id-Dipartiment tal-Prevenzjoni tal-Kanċer u l-Eżami Mediku taċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università ta 'Sun Yat-sen ġabar ġabra ta' serum minn 100 donatur b'saħħtu, inkluż numru ugwali ta 'irġiel u nisa ta' bejn 40 u 55 sena.Volumi ugwali ta 'kull kampjun donatur tħalltu, il-ġabra li tirriżulta kienet alikkwotata u maħżuna f'-80 ° C.It-taħlita tas-serum intużat bħala materjal ta' referenza għall-kontroll tal-kwalità u l-istandardizzazzjoni tad-dejta.
Is-serum ta' referenza u l-kampjuni tat-test ġew imdewweb u l-metaboliti ġew estratti permezz ta' metodu ta' estrazzjoni kkombinat (MTBE/metanol/ilma) 56 .Fil-qosor, 50 μl ta 'serum tħallat ma' 225 μl ta 'metanol kiesaħ bis-silġ u 750 μl ta' metil tert-butyl ether (MTBE) kiesaħ bis-silġ.Ħawwad it-taħlita u inkuba fuq is-silġ għal siegħa.Il-kampjuni mbagħad tħalltu u vortex imħallat ma '188 μl ta' ilma ta 'grad MS li fih standards interni (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, u 13C6-isoleucine, mixtrija minn Cambridge Isotope Laboratories).It-taħlita mbagħad ġiet ċentrifugata f'15,000 × g għal 10 min f'4 °C, u l-fażi t'isfel ġiet trasferita f'żewġ tubi (125 μL kull wieħed) għal analiżi LC-MS f'modi pożittivi u negattivi.Fl-aħħarnett, il-kampjun ġie evaporat sa nixfa f'konċentratur tal-vakwu ta 'veloċità għolja.
Il-metaboliti mnixxfa ġew rikostitwiti f'120 μl ta '80% acetonitrile, vortexed għal 5 min, u ċentrifugati f'15,000 × g għal 10 min f'4 ° C.Is-supernatanti ġew trasferiti f'kunjetti tal-ħġieġ ambra b'mikroinserts għal studji tal-metabolomika.Analiżi ta 'metabolomika mhux immirata fuq pjattaforma ta' kromatografija likwida ta 'spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS).Il-metaboliti ġew separati bl-użu ta 'sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC u kolonna ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Fil-modalità tal-jone pożittiv, il-fażijiet mobbli kienu 95% (A) u 50% acetonitrile (B), kull wieħed kien fih 10 mmol/L aċetat tal-ammonju u 0.1% aċidu formiku.Fil-modalità negattiva, il-fażijiet mobbli A u B kien fihom 95% u 50% acetonitrile, rispettivament, iż-żewġ fażijiet kien fihom 10 mmol / L aċetat tal-ammonju, pH = 9. Il-programm gradjent kien kif ġej: 0-0.5 min, 2% B;0.5-12 min, 2-50% B;12-14 min, 50-98% B;14-16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 min, 2% B. Il-kolonna nżammet f'40 ° C u l-kampjun f'10 ° C fl-awtosampler.Ir-rata tal-fluss kienet 0.3 ml/min, il-volum tal-injezzjoni kien 3 μl.Spettrometru tal-massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) b'sors ta 'jonizzazzjoni elettrospray (ESI) kien operat f'modalità ta' skan sħiħ u flimkien mal-mod ta 'monitoraġġ ddMS2 biex jiġbor volumi kbar ta' dejta.Il-parametri tal-MS ġew issettjati kif ġej: vultaġġ tal-bexx +3.8 kV/- 3.2 kV, temperatura kapillari 320°C, gass protettiv 40 arb, gass awżiljarju 10 arb, temperatura tal-heater tas-sonda 350°C, firxa tal-iskannjar 70-1050 m/ h, riżoluzzjoni.70 000. Id-dejta nkisbet bl-użu ta’ Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Biex tiġi vvalutata l-kwalità tad-dejta, kampjuni tal-kontroll tal-kwalità miġbura (QC) ġew ġġenerati billi tneħħew 10 μL alikwoti tas-supernatant minn kull kampjun.Sitt injezzjonijiet ta 'kampjun ta' kontroll tal-kwalità ġew analizzati fil-bidu tas-sekwenza analitika biex tiġi vvalutata l-istabbiltà tas-sistema UPLC-MS.Kampjuni tal-kontroll tal-kwalità huma mbagħad introdotti perjodikament fil-lott.Il-11-il lott ta' kampjuni tas-serum f'dan l-istudju ġew analizzati b'LC-MS.Alikwoti ta' taħlita ta' serum minn 100 donatur b'saħħithom intużaw bħala materjal ta' referenza f'lottijiet rispettivi biex jimmonitorjaw il-proċess ta' estrazzjoni u jaġġustaw għall-effetti minn lott għal lott.Analiżi tal-metabolomika mhux immirata tal-koorti tal-iskoperta, il-koorti tal-validazzjoni interna u l-koorti tal-validazzjoni esterna saret fiċ-Ċentru tal-Metabolomika tal-Università ta 'Sun Yat-sen.Il-laboratorju estern taċ-Ċentru tal-Analiżi u l-Ittestjar tal-Università tat-Teknoloġija ta 'Guangdong analizza wkoll 40 kampjun mill-koorti esterna biex jittestja l-prestazzjoni tal-mudell tal-klassifikatur.
Wara l-estrazzjoni u r-rikostituzzjoni, il-kwantifikazzjoni assoluta tal-metaboliti tas-serum ġiet imkejla bl-użu ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja-spettrometrija tal-massa tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) b'sors ta 'jonizzazzjoni elettrospray (ESI) fil-modalità ta' monitoraġġ ta 'reazzjoni multipla (MRM).Kolonna ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) intużat biex tissepara l-metaboliti.Il-fażi mobbli kienet tikkonsisti f'90% (A) u 5% acetonitrile (B) b'10 mmol/L aċetat tal-ammonju u 0.1% soluzzjoni tal-ammonja.Il-programm tal-gradjent kien kif ġej: 0-1.5 min, 0% B;1.5-6.5 min, 0-15% B;6.5-8 min, 15% B;8–8.5 min, 15%–0% B;8.5–11.5 min, 0%B.Il-kolonna nżammet f'40 °C u l-kampjun f'10 °C fl-awtosampler.Ir-rata tal-fluss kienet 0.3 mL/min u l-volum tal-injezzjoni kien 1 μL.Parametri MS ġew stabbiliti kif ġej: vultaġġ kapillari ± 3.5 kV, pressjoni nebulizzatur 35 psi, fluss tal-gass għant 12 L / min, temperatura tal-gass għant 350 ° C, temperatura tal-gass tat-tnixxif 250 ° C, u fluss tal-gass tat-tnixxif 14 l / min.Il-konverżjonijiet MRM ta 'tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine u xanthine kienu 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 u 151.0-107.9 rispettivament.Id-dejta nġabret bl-użu ta' Mass Hunter B.07.00 (Teknoloġiji Agilent).Għal kampjuni tas-serum, tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, u xanthine ġew kwantifikati bl-użu ta 'kurvi ta' kalibrazzjoni ta 'soluzzjonijiet ta' taħlita standard.Għall-kampjuni taċ-ċelluli, il-kontenut tat-tryptophan kien normalizzat għall-istandard intern u l-massa tal-proteina taċ-ċelluli.
L-estrazzjoni tal-quċċata (m/z u l-ħin ta 'ritenzjoni (RT)) saret bl-użu ta' Compound Discovery 3.1 u TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Biex jiġu eliminati d-differenzi potenzjali bejn il-lottijiet, kull quċċata karatteristika tal-kampjun tat-test kienet diviża bil-quċċata karatteristika tal-materjal ta 'referenza mill-istess lott biex tinkiseb l-abbundanza relattiva.Id-devjazzjonijiet standard relattivi ta 'standards interni qabel u wara l-istandardizzazzjoni huma murija fit-Tabella Supplimentari 6. Id-differenzi bejn iż-żewġ gruppi kienu kkaratterizzati minn rata ta' skoperta falza (FDR <0.05, test ta 'rank iffirmat Wilcoxon) u bidla darbiet (> 1.2 jew <0.83).Id-dejta mhux ipproċessata tal-MS tal-karatteristiċi estratti u d-dejta tal-MS ta' referenza kkoreġuta bis-serum huma murija f'Dejta Supplimentari 1 u Dejta Supplimentari 2, rispettivament.L-annotazzjoni tal-quċċata twettqet ibbażata fuq erba 'livelli definiti ta' identifikazzjoni, inklużi metaboliti identifikati, komposti annotati putattiv, klassijiet ta 'komposti kkaratterizzati b'mod putattiv, u komposti mhux magħrufa 22 .Ibbażat fuq it-tfittxijiet fid-database f'Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), komposti bijoloġiċi bi standards validati li jaqblu MS/MS jew annotazzjonijiet ta 'taqbila eżatta f'mzCloud (punteġġ> 85) jew Chemspider ġew finalment magħżula bħala intermedji bejn il-metaboloma differenzjali.L-annotazzjonijiet tal-ogħla livell għal kull karatteristika huma inklużi f'Dejta Supplimentari 3. MetaboAnalyst 5.0 intuża għal analiżi univarjata tal-abbundanza tal-metaboliti normalizzati b'somma.MetaboAnalyst 5.0 evalwa wkoll analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG ibbażata fuq metaboliti differenti b'mod sinifikanti.L-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) u l-analiżi diskriminanti tal-inqas kwadri parzjali (PLS-DA) ġew analizzati bl-użu tal-pakkett tas-softwer ropls (v.1.26.4) b'normalizzazzjoni tal-munzell u awtoscaling.Il-mudell ottimali tal-bijomarkatur tal-metabolit għat-tbassir tal-malinn tan-nodulu ġie ġġenerat bl-użu ta 'rigressjoni loġistika binarja bl-inqas operatur ta' tnaqqis assolut u għażla (LASSO, pakkett R v.4.1-3).Il-prestazzjoni tal-mudell diskriminanti fis-settijiet ta' skoperta u validazzjoni kienet ikkaratterizzata minn stima tal-AUC ibbażata fuq analiżi ROC skont il-pakkett pROC (v.1.18.0.).Il-qtugħ tal-probabbiltà ottimali nkiseb ibbażat fuq l-indiċi Youden massimu tal-mudell (sensittività + speċifiċità - 1).Kampjuni b'valuri anqas jew akbar mil-limitu se jkunu mbassra bħala noduli beninni u adenokarċinoma tal-pulmun, rispettivament.
Iċ-ċelloli A549 (#CCL-185, Ġbir tal-Kultura tat-Tip Amerikan) tkabbru f'medja F-12K li fiha 10% FBS.Sekwenzi qosra ta' hairpin RNA (shRNA) immirati lejn SLC7A5 u kontroll nontargeting (NC) ġew imdaħħla fil-vettur lentivirali pLKO.1-puro.Is-sekwenzi antisens ta 'shSLC7A5 huma kif ġej: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antikorpi għal SLC7A5 (#5347) u tubulin (#2148) inxtraw minn Cell Signaling Technology.Antikorpi għal SLC7A5 u tubulin intużaw f'dilwizzjoni ta '1:1000 għall-analiżi Western blot.
Is-Seahorse XF Glycolytic Stress Test ikejjel il-livelli ta' aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR).Fl-assaġġ, glucose, oligomycin A, u 2-DG ġew amministrati b'mod sekwenzjali biex tiġi ttestjata l-kapaċità glikolitika ċellulari kif imkejla mill-ECAR.
Iċ-ċelloli A549 trasfettati b'kontroll mhux immirat (NC) u shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ġew ibbanjati matul il-lejl f'platti b'dijametru ta '10 ċm.Il-metaboliti taċ-ċelluli ġew estratti b'1 ml ta' metanol akweju 80% kiesaħ bis-silġ.Iċ-ċelloli fis-soluzzjoni tal-metanol ġew mibruxa, miġbura f'tubu ġdid, u ċentrifugati f'15,000 × g għal 15-il minuta f'4 ° C.Iġbor 800 µl ta' supernatant u nixxef billi tuża konċentratur tal-vakwu ta' veloċità għolja.Il-gerbub tal-metaboliti mnixxfa mbagħad ġew analizzati għal-livelli ta 'triptofan bl-użu ta' LC-MS/MS kif deskritt hawn fuq.Il-livelli ċellulari ta 'NAD(H) fiċ-ċelloli A549 (NC u shSLC7A5) ġew imkejla bl-użu ta' kit kolorimetriku kwantitattiv NAD+/NADH (#K337, BioVision) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.Il-livelli tal-proteini ġew imkejla għal kull kampjun biex jiġi normalizzat l-ammont ta 'metaboliti.
L-ebda metodu statistiku ma ntuża biex jiġi ddeterminat b'mod preliminari d-daqs tal-kampjun.Studji ta 'metabolomika preċedenti mmirati lejn l-iskoperta tal-bijomarkaturi15,18 ġew ikkunsidrati bħala punti ta' referenza għad-determinazzjoni tad-daqs, u meta mqabbla ma 'dawn ir-rapporti, il-kampjun tagħna kien adegwat.L-ebda kampjun ma ġie eskluż mill-koorti tal-istudju.Kampjuni tas-serum ġew assenjati b'mod każwali għal grupp ta 'skoperta (306 każi, 74.6%) u grupp ta' validazzjoni interna (104 każi, 25.4%) għal studji ta 'metabolomics mhux immirati.Aħna wkoll għażilna b'mod każwali 70 każ minn kull grupp mis-sett ta 'skoperti għal studji ta' metabolomika mmirati.L-investigaturi kienu blinded għall-assenjazzjoni tal-grupp waqt il-ġbir u l-analiżi tad-dejta LC-MS.Analiżi statistiċi tad-dejta tal-metabolomika u l-esperimenti taċ-ċelluli huma deskritti fit-taqsimiet rispettivi tar-Riżultati, il-Leġġendi tal-Figura, u l-Metodi.Kwantifikazzjoni ta 'triptofan ċellulari, NADT, u attività glikolitika twettqet tliet darbiet b'mod indipendenti b'riżultati identiċi.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-Astratt tar-Rapport tal-Portfolio Naturali assoċjat ma 'dan l-artikolu.
Id-dejta mhux ipproċessata tal-MS tal-karatteristiċi estratti u d-dejta tal-MS normalizzata tas-serum ta’ referenza huma murija f’Dejta Supplimentari 1 u Dejta Supplimentari 2, rispettivament.L-annotazzjonijiet tal-ogħla livell għall-karatteristiċi differenzjali huma ppreżentati f'Dejta Supplimentari 3. Is-sett tad-dejta LUAD TCGA jista 'jitniżżel minn https://portal.gdc.cancer.gov/.Id-dejta tal-input għat-tpinġija tal-graff hija pprovduta fid-dejta tas-sors.Id-dejta tas-sors hija pprovduta għal dan l-artikolu.
Grupp ta' Studju Nazzjonali tal-Iscreening tal-Pulmun, eċċ. Tnaqqis tal-mortalità mill-kanċer tal-pulmun b'tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa.Tramuntana tal-Ingilterra.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR u Profeta, PC Screening tal-kanċer tal-pulmun bl-użu ta 'CT helical ta' doża baxxa: riżultati mill-Istudju Nazzjonali tal-Iscreening tal-Pulmun (NLST).J. Med.Skrin 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Tnaqqis tal-mortalità mill-kanċer tal-pulmun bi screening volumetriku CT fi prova randomised.Tramuntana tal-Ingilterra.J. Med.382, 503–513 (2020).
Ħin tal-post: Settembru-18-2023