Id-dijanjosi differenzjali tan-noduli pulmonari identifikati permezz tat-tomografija kompjuterizzata (CT) tibqa' sfida fil-prattika klinika. Hawnhekk, nikkaratterizzaw il-metaboloma globali ta' 480 kampjun tas-serum, inklużi kontrolli b'saħħithom, noduli beninni tal-pulmun, u adenokarċinoma tal-pulmun ta' stadju I. L-adenokarċinomi juru profili metabolomiċi uniċi, filwaqt li n-noduli beninni u l-individwi b'saħħithom għandhom similarità għolja fil-profili metabolomiċi. Fil-grupp ta' skoperta (n = 306), ġie identifikat sett ta' 27 metabolit biex jiddistingwi bejn noduli beninni u malinni. L-AUC tal-mudell diskriminanti fil-gruppi ta' validazzjoni interna (n = 104) u validazzjoni esterna (n = 111) kienet 0.915 u 0.945, rispettivament. L-analiżi tal-mogħdija żvelat żieda fil-metaboliti glikolitiċi assoċjati ma' tnaqqis fit-triptofan fis-serum tal-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbel man-noduli beninni u l-kontrolli b'saħħithom, u ssuġġeriet li l-assorbiment tat-triptofan jippromwovi l-glikoliżi fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun. L-istudju tagħna jenfasizza l-valur tal-bijomarkaturi tal-metaboliti fis-serum fil-valutazzjoni tar-riskju ta' noduli pulmonari skoperti permezz ta' CT.
Dijanjosi bikrija hija kritika biex tittejjeb ir-rati ta’ sopravivenza għall-pazjenti bil-kanċer. Ir-riżultati mill-US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) u l-European NELSON Study urew li l-iskrinjar b’tomografija kompjuterizzata b’doża baxxa (LDCT) jista’ jnaqqas b’mod sinifikanti l-mortalità mill-kanċer tal-pulmun fi gruppi b’riskju għoli1,2,3. Minn mindu l-użu mifrux tal-LDCT għall-iskrinjar tal-kanċer tal-pulmun, l-inċidenza ta’ sejbiet radjografiċi inċidentali ta’ noduli pulmonari asintomatiċi kompliet tiżdied4. In-noduli pulmonari huma definiti bħala opakitajiet fokali sa 3 ċm fid-dijametru5. Qed niffaċċjaw diffikultajiet biex nivvalutaw il-probabbiltà ta’ malignità u nittrattaw l-għadd kbir ta’ noduli pulmonari skoperti inċidentalment fuq l-LDCT. Il-limitazzjonijiet tas-CT jistgħu jwasslu għal eżamijiet ta’ segwitu frekwenti u riżultati foloz-pożittivi, li jwasslu għal intervent bla bżonn u trattament żejjed6. Għalhekk, hemm bżonn li jiġu żviluppati bijomarkaturi affidabbli u utli biex jiġi identifikat b’mod korrett il-kanċer tal-pulmun fl-istadji bikrija u jiġu differenzjati l-biċċa l-kbira tan-noduli beninni fl-iskoperta inizjali7.
Analiżi molekulari komprensiva tad-demm (serum, plażma, ċelluli mononukleari tad-demm periferali), inklużi l-ġenomika, il-proteomika jew il-metilazzjoni tad-DNA8,9,10, wasslet għal interess dejjem jikber fl-iskoperta ta' bijomarkaturi dijanjostiċi għall-kanċer tal-pulmun. Sadanittant, l-approċċi metabolomiċi jkejlu l-prodotti finali ċellulari li huma influwenzati minn azzjonijiet endoġeni u eżoġeni u għalhekk huma applikati biex ibassru l-bidu u r-riżultat tal-marda. Kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa tandem (LC-MS) hija metodu użat ħafna għal studji metabolomiċi minħabba s-sensittività għolja tagħha u l-firxa dinamika kbira, li tista' tkopri metaboliti bi proprjetajiet fiżikokimiċi differenti11,12,13. Għalkemm l-analiżi metabolomika globali tal-plażma/serum intużat biex tidentifika bijomarkaturi assoċjati mad-dijanjosi tal-kanċer tal-pulmun14,15,16,17 u l-effikaċja tat-trattament,18 il-klassifikaturi tal-metaboliti tas-serum biex jiddistingwu bejn noduli beninni u malinni tal-pulmun għad iridu jiġu studjati ħafna. -riċerka massiva.
L-adenokarċinoma u l-karċinoma taċ-ċelluli skwamużi huma ż-żewġ sottotipi ewlenin ta’ kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC). Diversi testijiet ta’ skrinjar tas-CT jindikaw li l-adenokarċinoma hija l-aktar tip istoloġiku komuni ta’ kanċer tal-pulmun1,19,20,21. F’dan l-istudju, użajna kromatografija likwida ta’ prestazzjoni ultra-kbira-spettrometrija tal-massa b’riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS) biex inwettqu analiżi metabolomika fuq total ta’ 695 kampjun tas-serum, inklużi kontrolli b’saħħithom, noduli pulmonari beninni, u ≤3 ċm skoperti bis-CT. Skrinjar għal adenokarċinoma tal-pulmun Stadju I. Identifikajna panel ta’ metaboliti fis-serum li jiddistingwu l-adenokarċinoma tal-pulmun minn noduli beninni u kontrolli b’saħħithom. L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija żvelat li l-metaboliżmu anormali tat-triptofan u l-glukożju huma alterazzjonijiet komuni fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma’ noduli beninni u kontrolli b’saħħithom. Fl-aħħar nett, stabbilixxejna u vvalidajna klassifikatur metaboliku tas-serum b'speċifiċità u sensittività għolja biex jiddistingwi bejn noduli pulmonari malinni u beninni skoperti permezz ta' LDCT, li jista' jgħin fid-dijanjosi differenzjali bikrija u l-valutazzjoni tar-riskju.
Fl-istudju attwali, kampjuni tas-serum imqabbla skont is-sess u l-età nġabru b'mod retrospettiv minn 174 kontroll b'saħħtu, 292 pazjent b'noduli pulmonari beninni, u 229 pazjent b'adenokarċinoma tal-pulmun fl-istadju I. Il-karatteristiċi demografiċi tas-695 suġġett huma murija fit-Tabella Supplimentari 1.
Kif muri fil-Figura 1a, total ta' 480 kampjun tas-serum, inklużi 174 kontroll b'saħħtu (HC), 170 nodulu beninni (BN), u 136 kampjun ta' adenokarċinoma tal-pulmun (LA) tal-istadju I, inġabru fiċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università Sun Yat-sen. Koorti ta' skoperta għal profiling metabolomiku mhux immirat bl-użu ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS). Kif muri fil-Figura Supplimentari 1, metaboliti differenzjali bejn LA u HC, LA u BN ġew identifikati biex jiġi stabbilit mudell ta' klassifikazzjoni u tiġi esplorata aktar l-analiżi tal-mogħdija differenzjali. 104 kampjun miġbura miċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università Sun Yat-sen u 111-il kampjun miġbura minn żewġ sptarijiet oħra ġew soġġetti għal validazzjoni interna u esterna, rispettivament.
a Popolazzjoni ta' studju fil-koorti ta' skoperta li għaddiet minn analiżi metabolomika tas-serum globali bl-użu ta' kromatografija likwida ultra-prestazzjoni-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS). b Analiżi diskriminanti tal-inqas kwadri parzjali (PLS-DA) tal-metaboloma totali ta' 480 kampjun tas-serum mill-koorti ta' studju, inklużi kontrolli b'saħħithom (HC, n = 174), noduli beninni (BN, n = 170), u adenokarċinoma tal-pulmun ta' stadju I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mod ta' jonizzazzjoni elettrosprej pożittiva, -ESI, mod ta' jonizzazzjoni elettrosprej negattiva. c–e Metaboliti b'abbundanzi sinifikament differenti f'żewġ gruppi mogħtija (test ta' rank iffirmat ta' Wilcoxon b'żewġ dnub, valur p aġġustat għar-rata ta' skoperta falza, FDR <0.05) huma murija bl-aħmar (bidla ta' darba > 1.2) u blu (bidla ta' darba < 0.83). ) murija fuq il-grafika tal-vulkan. f Mappa tas-sħana ta' raggruppament ġerarkiku li turi differenzi sinifikanti fin-numru ta' metaboliti annotati bejn LA u BN. Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta' fajls tad-dejta tas-sors.
Il-metaboloma totali tas-serum ta' 174 HC, 170 BN u 136 LA fil-grupp ta' skoperta ġiet analizzata bl-użu tal-analiżi UPLC-HRMS. L-ewwel nuru li l-kampjuni tal-kontroll tal-kwalità (QC) jinġabru flimkien fiċ-ċentru ta' mudell ta' analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) mhux sorveljat, u dan jikkonferma l-istabbiltà tal-prestazzjoni tal-istudju attwali (Figura Supplimentari 2).
Kif muri fl-analiżi parzjali tal-inqas kwadri diskriminanti (PLS-DA) fil-Figura 1b, sibna li kien hemm differenzi ċari bejn LA u BN, LA u HC fil-modi ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej pożittivi (+ESI) u negattivi (−ESI). Madankollu, ma nstabet l-ebda differenza sinifikanti bejn BN u HC fil-kundizzjonijiet +ESI u -ESI.
Sibna 382 karatteristika differenzjali bejn LA u HC, 231 karatteristika differenzjali bejn LA u BN, u 95 karatteristika differenzjali bejn BN u HC (test tal-grad iffirmat ta' Wilcoxon, FDR <0.05 u bidla multipla >1.2 jew <0.83) (Figura .1c-e). . Il-qċaċet ġew annotati aktar (Data Supplimentari 3) kontra database (librerija mzCloud/HMDB/Chemspider) permezz tal-valur m/z, il-ħin ta' żamma u t-tfittxija tal-ispettru tal-massa tal-frammentazzjoni (dettalji deskritti fit-taqsima tal-Metodi) 22. Fl-aħħar nett, ġew identifikati 33 u 38 metabolit annotat b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza għal LA kontra BN (Figura 1f u Tabella Supplimentari 2) u LA kontra HC (Figura Supplimentari 3 u Tabella Supplimentari 2), rispettivament. B'kuntrast, ġew identifikati biss 3 metaboliti b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza f'BN u HC (Tabella Supplimentari 2), konsistenti mas-sovrappożizzjoni bejn BN u HC fil-PLS-DA. Dawn il-metaboliti differenzjali jkopru firxa wiesgħa ta' bijokimiċi (Figura Supplimentari 4). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati juru bidliet sinifikanti fil-metaboloma tas-serum li jirriflettu t-trasformazzjoni malinna tal-kanċer tal-pulmun fi stadju bikri meta mqabbel ma' noduli beninni tal-pulmun jew suġġetti b'saħħithom. Sadanittant, ix-xebh tal-metaboloma tas-serum ta' BN u HC jissuġġerixxi li n-noduli pulmonari beninni jistgħu jaqsmu ħafna karatteristiċi bijoloġiċi ma' individwi b'saħħithom. Minħabba li l-mutazzjonijiet tal-ġene tar-riċettur tal-fattur tat-tkabbir epidermali (EGFR) huma komuni fis-sottotip 23 tal-adenokarċinoma tal-pulmun, fittixna li niddeterminaw l-impatt tal-mutazzjonijiet tas-sewwieqa fuq il-metaboloma tas-serum. Imbagħad analizzajna l-profil metabolomiku ġenerali ta' 72 każ bi status EGFR fil-grupp tal-adenokarċinoma tal-pulmun. Interessanti, sibna profili komparabbli bejn pazjenti mutanti EGFR (n = 41) u pazjenti tat-tip selvaġġ EGFR (n = 31) fl-analiżi PCA (Figura Supplimentari 5a). Madankollu, identifikajna 7 metaboliti li l-abbundanza tagħhom inbidlet b'mod sinifikanti f'pazjenti b'mutazzjoni tal-EGFR meta mqabbla ma' pazjenti b'EGFR tat-tip selvaġġ (test t, p < 0.05 u bidla ta' drabi > 1.2 jew < 0.83) (Figura Supplimentari 5b). Il-maġġoranza ta' dawn il-metaboliti (5 minn 7) huma aċilkarnitini, li għandhom rwol importanti fil-mogħdijiet tal-ossidazzjoni tal-aċidi grassi.
Kif muri fil-fluss tax-xogħol muri fil-Figura 2a, il-bijomarkaturi għall-klassifikazzjoni tan-noduli nkisbu bl-użu ta' operaturi tal-inqas tnaqqis assolut u għażla bbażata fuq 33 metabolit differenzjali identifikati f'LA (n = 136) u BN (n = 170). L-aħjar kombinazzjoni ta' varjabbli (LASSO) – mudell ta' rigressjoni loġistika binarja. Intużat validazzjoni inkroċjata ta' għaxar darbiet biex tiġi ttestjata l-affidabbiltà tal-mudell. L-għażla tal-varjabbli u r-regolarizzazzjoni tal-parametri huma aġġustati b'penali ta' massimizzazzjoni tal-probabbiltà bil-parametru λ24. Analiżi metabolomika globali twettqet aktar b'mod indipendenti fil-gruppi ta' validazzjoni interna (n = 104) u validazzjoni esterna (n = 111) biex tiġi ttestjata l-prestazzjoni tal-klassifikazzjoni tal-mudell diskriminanti. Bħala riżultat, 27 metabolit fis-sett ta' skoperta ġew identifikati bħala l-aħjar mudell diskriminanti bl-akbar valur medju tal-AUC (Fig. 2b), li fosthom 9 kellhom attività miżjuda u 18 attività mnaqqsa f'LA meta mqabbla ma' BN (Fig. 2c).
Fluss tax-xogħol għall-bini ta' klassifikatur tan-noduli pulmonari, inkluż l-għażla tal-aħjar panel ta' metaboliti fis-serum fis-sett ta' skoperta bl-użu ta' mudell ta' rigressjoni loġistika binarja permezz ta' validazzjoni inkroċjata ta' għaxar darbiet u l-evalwazzjoni tal-prestazzjoni predittiva f'settijiet ta' validazzjoni interni u esterni. b Statistiċi ta' validazzjoni inkroċjata tal-mudell ta' rigressjoni LASSO għall-għażla tal-bijomarkaturi metaboliċi. In-numri mogħtija hawn fuq jirrappreżentaw in-numru medju ta' bijomarkaturi magħżula f'λ partikolari. Il-linja bit-tikek ħamra tirrappreżenta l-valur medju tal-AUC fil-lambda korrispondenti. Il-vireg tal-iżbalji griżi jirrappreżentaw il-valuri minimi u massimi tal-AUC. Il-linja bit-tikek tindika l-aħjar mudell bis-27 bijomarkatur magħżul. AUC, erja taħt il-kurva tal-karatteristika operattiva tar-riċevitur (ROC). c Bidliet fid-dawriet ta' 27 metabolit magħżul fil-grupp LA meta mqabbla mal-grupp BN fil-grupp ta' skoperta. Kolonna ħamra – attivazzjoni. Il-kolonna blu hija tnaqqis. d–f Kurvi tal-karatteristika operattiva tar-riċevitur (ROC) li juru l-qawwa tal-mudell diskriminant ibbażat fuq 27 kombinazzjoni ta' metaboliti fis-settijiet ta' validazzjoni ta' skoperta, interni u esterni. Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta' fajls tad-dejta tas-sors.
Inħoloq mudell ta' tbassir ibbażat fuq il-koeffiċjenti ta' rigressjoni ppeżati ta' dawn is-27 metaboliti (Tabella Supplimentari 3). L-analiżi ROC ibbażata fuq dawn is-27 metaboliti tat valur ta' erja taħt il-kurva (AUC) ta' 0.933, is-sensittività tal-grupp ta' skoperta kienet ta' 0.868, u l-ispeċifiċità kienet ta' 0.859 (Fig. 2d). Sadanittant, fost it-38 metabolit differenzjali annotati bejn LA u HC, sett ta' 16-il metabolit kisbu AUC ta' 0.902 b'sensittività ta' 0.801 u speċifiċità ta' 0.856 fid-diskriminazzjoni bejn LA u HC (Figura Supplimentari 6a-c). Il-valuri tal-AUC ibbażati fuq limiti ta' bidla differenti għal metaboliti differenzjali ġew imqabbla wkoll. Sibna li l-mudell ta' klassifikazzjoni ħadem l-aħjar fid-diskriminazzjoni bejn LA u BN (HC) meta l-livell ta' bidla kien issettjat għal 1.2 kontra 1.5 jew 2.0 (Figura Supplimentari 7a,b). Il-mudell ta' klassifikazzjoni, ibbażat fuq 27 grupp ta' metaboliti, ġie vvalidat aktar f'koorti interni u esterni. L-AUC kienet 0.915 (sensittività 0.867, speċifiċità 0.811) għall-validazzjoni interna u 0.945 (sensittività 0.810, speċifiċità 0.979) għall-validazzjoni esterna (Fig. 2e, f). Biex tiġi vvalutata l-effiċjenza interlaboratorja, 40 kampjun mill-koorti esterna ġew analizzati f'laboratorju estern kif deskritt fit-taqsima tal-Metodi. L-eżattezza tal-klassifikazzjoni laħqet AUC ta' 0.925 (Figura Supplimentari 8). Minħabba li l-karċinoma taċ-ċelluli skwamużi tal-pulmun (LUSC) hija t-tieni l-aktar sottotip komuni ta' kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC) wara l-adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD), ittestjajna wkoll l-utilità potenzjali vvalidata tal-profili metaboliċi. BN u 16-il każ ta' LUSC. L-AUC ta' diskriminazzjoni bejn LUSC u BN kienet 0.776 (Figura Supplimentari 9), li tindika kapaċità ifqar meta mqabbla mad-diskriminazzjoni bejn LUAD u BN.
Studji wrew li d-daqs tan-noduli fuq l-immaġini tas-CT huwa korrelatat b'mod pożittiv mal-probabbiltà ta' malignità u jibqa' determinanti ewlieni tat-trattament tan-noduli25,26,27. L-analiżi tad-dejta mill-koorti kbira tal-istudju ta' skrinjar NELSON uriet li r-riskju ta' malignità f'suġġetti b'noduli <5 mm kien saħansitra simili għal dak f'suġġetti mingħajr noduli 28. Għalhekk, id-daqs minimu li jeħtieġ monitoraġġ regolari tas-CT huwa 5 mm, kif rakkomandat mill-British Thoracic Society (BTS), u 6 mm, kif rakkomandat mill-Fleischner Society 29. Madankollu, noduli akbar minn 6 mm u mingħajr karatteristiċi beninni ovvji, imsejħa noduli pulmonari indeterminati (IPN), jibqgħu sfida ewlenija fl-evalwazzjoni u l-ġestjoni fil-prattika klinika30,31. Imbagħad eżaminajna jekk id-daqs tan-noduli influwenzax il-firem metabolomiċi bl-użu ta' kampjuni miġbura mill-koorti ta' skoperta u validazzjoni interna. Billi ffokajna fuq 27 bijomarkatur validat, l-ewwel qabbilna l-profili PCA tal-metabolomi HC u BN sub-6 mm. Sibna li l-biċċa l-kbira tal-punti tad-dejta għal HC u BN kienu jikkoinċidu, u dan juri li l-livelli tal-metaboliti fis-serum kienu simili fiż-żewġ gruppi (Fig. 3a). Il-mapep tal-karatteristiċi f'firxiet ta' daqsijiet differenti baqgħu kkonservati f'BN u LA (Fig. 3b, c), filwaqt li ġiet osservata separazzjoni bejn noduli malinni u beninni fil-medda ta' 6–20 mm (Fig. 3d). Din il-koorti kellha AUC ta' 0.927, speċifiċità ta' 0.868, u sensittività ta' 0.820 għat-tbassir tal-malinnità ta' noduli li jkejlu minn 6 sa 20 mm (Fig. 3e, f). Ir-riżultati tagħna juru li l-klassifikatur jista' jaqbad bidliet metaboliċi kkawżati minn trasformazzjoni malinni bikrija, irrispettivament mid-daqs tan-noduli.
ad Paragun tal-profili tal-PCA bejn gruppi speċifikati bbażat fuq klassifikatur metaboliku ta' 27 metabolit. CC u BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. f'LA 6–20 mm kontra LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm u LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva tal-karatteristika operattiva tar-riċevitur (ROC) li turi l-prestazzjoni tal-mudell diskriminant għal noduli 6–20 mm. f Il-valuri tal-probabbiltà ġew ikkalkulati abbażi tal-mudell ta' rigressjoni loġistika għal noduli li jkejlu 6–20 mm. Il-linja griża bit-tikek tirrappreżenta l-valur ottimali tal-limitu (0.455). In-numri ta' hawn fuq jirrappreżentaw il-perċentwal ta' każijiet ipproġettati għal Los Angeles. Uża test t ta' Student b'żewġ dnub. PCA, analiżi tal-komponenti prinċipali. Żona AUC taħt il-kurva. Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta' fajls tad-dejta tas-sors.
Erba' kampjuni (ta' bejn 44 u 61 sena) b'daqsijiet simili ta' noduli pulmonari (7–9 mm) ġew magħżula aktar biex juru l-prestazzjoni tal-mudell propost ta' tbassir tal-malinnità (Fig. 4a, b). Fl-iskrinjar inizjali, il-Każ 1 ippreżenta ruħu bħala nodulu solidu b'kalċifikazzjoni, karatteristika assoċjata mal-beninnità, filwaqt li l-Każ 2 ippreżenta ruħu bħala nodulu parzjalment solidu indeterminat mingħajr karatteristiċi beninni ovvji. Tliet rawnds ta' CT scans ta' segwitu wrew li dawn il-każijiet baqgħu stabbli fuq perjodu ta' 4 snin u għalhekk kienu kkunsidrati bħala noduli beninni (Fig. 4a). Meta mqabbla mal-evalwazzjoni klinika ta' CT scans serjali, analiżi tal-metaboliti fis-serum b'doża waħda bil-mudell ta' klassifikatur attwali identifikat malajr u b'mod korrett dawn in-noduli beninni bbażati fuq restrizzjonijiet probabbilistiċi (Tabella 1). Il-Figura 4b fil-każ 3 turi nodulu b'sinjali ta' retrazzjoni plewrali, li ħafna drabi hija assoċjata ma' malinnità32. Il-Każ 4 ippreżenta ruħu bħala nodulu parzjalment solidu indeterminat mingħajr evidenza ta' kawża beninna. Dawn il-każijiet kollha kienu mbassra bħala malinni skont il-mudell tal-klassifikatur (Tabella 1). Il-valutazzjoni tal-adenokarċinoma tal-pulmun intweriet permezz ta' eżami istopatoloġiku wara kirurġija ta' resezzjoni tal-pulmun (Fig. 4b). Għas-sett ta' validazzjoni esterna, il-klassifikatur metaboliku bassar b'mod preċiż żewġ każijiet ta' noduli tal-pulmun indeterminati akbar minn 6 mm (Figura Supplimentari 10).
Immaġni CT tat-tieqa assjali tal-pulmuni ta' żewġ każijiet ta' noduli beninni. Fil-każ 1, skan CT wara 4 snin wera nodulu solidu stabbli li jkejjel 7 mm b'kalċifikazzjoni fil-lobu t'isfel tal-lemin. Fil-każ 2, skan CT wara 5 snin żvela nodulu stabbli, parzjalment solidu b'dijametru ta' 7 mm fil-lobu ta' fuq tal-lemin. b Immaġni CT tat-tieqa assjali tal-pulmuni u studji patoloġiċi korrispondenti ta' żewġ każijiet ta' adenokarċinoma ta' stadju I qabel ir-resezzjoni tal-pulmun. Il-każ 3 żvela nodulu b'dijametru ta' 8 mm fil-lobu ta' fuq tal-lemin b'retrazzjoni plewrali. Il-każ 4 żvela nodulu tal-ħġieġ mitħun parzjalment solidu li jkejjel 9 mm fil-lobu ta' fuq tax-xellug. Tbajja' ta' ematoxylin u eosin (H&E) tat-tessut tal-pulmun imneħħi (skala bar = 50 μm) li turi l-mudell ta' tkabbir aċinari tal-adenokarċinoma tal-pulmun. Il-vleġeġ jindikaw noduli skoperti fuq l-immaġni CT. L-immaġni H&E huma immaġni rappreżentattivi ta' kampi mikroskopiċi multipli (>3) eżaminati mill-patologu.
Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna juru l-valur potenzjali tal-bijomarkaturi tal-metaboliti tas-serum fid-dijanjosi differenzjali tan-noduli pulmonari, li jistgħu joħolqu sfidi meta jiġi evalwat l-iskrinjar tas-CT.
Abbażi ta' panel ta' metaboliti differenzjali vvalidati, fittixna li nidentifikaw korrelati bijoloġiċi ta' bidliet metaboliċi ewlenin. L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG minn MetaboAnalyst identifikat 6 mogħdijiet komuni mibdula b'mod sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi mogħtija (LA vs. HC u LA vs. BN, p aġġustat ≤ 0.001, effett > 0.01). Dawn il-bidliet kienu kkaratterizzati minn disturbi fil-metaboliżmu tal-piruvat, il-metaboliżmu tat-triptofan, il-metaboliżmu tan-niaċina u n-nikotinamide, il-glikolisi, iċ-ċiklu TCA, u l-metaboliżmu tal-purina (Fig. 5a). Imbagħad wettaqna aktar metabolomiċi mmirati biex nivverifikaw il-bidliet ewlenin bl-użu ta' kwantifikazzjoni assoluta. Determinazzjoni ta' metaboliti komuni f'mogħdijiet mibdula komunement permezz ta' spettrometrija tal-massa tripla kwadrupola (QQQ) bl-użu ta' standards awtentiċi tal-metaboliti. Il-karatteristiċi demografiċi tal-kampjun fil-mira tal-istudju metabolomiku huma inklużi fit-Tabella Supplimentari 4. B'konsistenza mar-riżultati metabolomiċi globali tagħna, l-analiżi kwantitattiva kkonfermat li l-ipoxantina u l-xantina, il-piruvat, u l-lattat żdiedu fl-LA meta mqabbla mal-BN u l-HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Madankollu, ma nstabet l-ebda differenza sinifikanti f'dawn il-metaboliti bejn il-BN u l-HC.
Analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG ta' metaboliti sinifikament differenti fil-grupp LA meta mqabbla mal-gruppi BN u HC. Intuża Globaltest b'żewġ dnub, u l-valuri p ġew aġġustati bl-użu tal-metodu Holm-Bonferroni (p aġġustat ≤ 0.001 u daqs tal-effett > 0.01). b–d Plotts tal-vjolin li juru l-livelli ta' ipoxantina, xantina, lattat, piruvat, u triptofan fis-serum HC, BN, u LA determinati minn LC-MS/MS (n = 70 għal kull grupp). Linji bojod u suwed bit-tikek jindikaw il-medjan u l-kwartil, rispettivament. e Plott tal-vjolin li juri l-espressjoni normalizzata tal-mRNA Log2TPM (traskrizzjonijiet għal kull miljun) ta' SLC7A5 u QPRT f'adenokarċinoma tal-pulmun (n = 513) meta mqabbla ma' tessut normali tal-pulmun (n = 59) fid-dataset LUAD-TCGA. Il-kaxxa bajda tirrappreżenta l-medda interkwartili, il-linja sewda orizzontali fiċ-ċentru tirrappreżenta l-medjan, u l-linja sewda vertikali li testendi mill-kaxxa tirrappreżenta l-intervall ta' kunfidenza ta' 95% (CI). f Plott ta' korrelazzjoni ta' Pearson tal-espressjoni ta' SLC7A5 u GAPDH fl-adenokarċinoma tal-pulmun (n = 513) u t-tessut normali tal-pulmun (n = 59) fid-dataset tat-TCGA. Iż-żona griża tirrappreżenta s-CI ta' 95%. r, Koeffiċjent ta' korrelazzjoni ta' Pearson. g Livelli normalizzati ta' triptofan ċellulari f'ċelloli A549 trasfettati b'kontroll shRNA mhux speċifiku (NC) u shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinati minn LC-MS/MS. Analiżi statistika ta' ħames kampjuni bijoloġikament indipendenti f'kull grupp hija ppreżentata. h Livelli ċellulari ta' NADt (NAD totali, inklużi NAD+ u NADH) f'ċelloli A549 (NC) u ċelloli A549 SLC7A5 knockdown (Sh1, Sh2). Analiżi statistika ta' tliet kampjuni bijoloġikament indipendenti f'kull grupp hija ppreżentata. i L-attività glikolitika taċ-ċelloli A549 qabel u wara t-tnaqqis ta' SLC7A5 ġiet imkejla bir-rata ta' aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR) (n = 4 kampjuni bijoloġikament indipendenti għal kull grupp). 2-DG,2-deoxy-D-glucose. It-test t ta' Student b'żewġ dnub intuża f'(b–h). F'(g–i), il-vireg tal-iżball jirrappreżentaw il-medja ± SD, kull esperiment twettaq tliet darbiet b'mod indipendenti u r-riżultati kienu simili. Id-dejta tas-sors hija pprovduta fil-forma ta' fajls tad-dejta tas-sors.
Meta nqisu l-impatt sinifikanti tal-metaboliżmu mibdul tat-triptofan fil-grupp LA, ivvalutajna wkoll il-livelli tat-triptofan fis-serum fil-gruppi HC, BN, u LA bl-użu ta' QQQ. Sibna li t-triptofan fis-serum kien imnaqqas f'LA meta mqabbel ma' HC jew BN (p < 0.001, Figura 5d), li huwa konsistenti ma' sejbiet preċedenti li l-livelli ta' triptofan fiċ-ċirkolazzjoni huma aktar baxxi f'pazjenti bil-kanċer tal-pulmun milli f'kontrolli b'saħħithom mill-grupp ta' kontroll33,34,35. Studju ieħor bl-użu tat-traċċatur PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan sab li l-ħin taż-żamma tas-sinjal tat-triptofan fit-tessut tal-kanċer tal-pulmun żdied b'mod sinifikanti meta mqabbel ma' leżjonijiet beninni jew tessut normali36. Aħna nissoponu li t-tnaqqis fit-triptofan fis-serum LA jista' jirrifletti l-assorbiment attiv tat-triptofan miċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun.
Huwa magħruf ukoll li l-prodott finali tal-mogħdija tal-kynurenine tal-kataboliżmu tat-triptofan huwa NAD+37,38, li huwa sottostrat importanti għar-reazzjoni tal-glyceraldehyde-3-phosphate ma' 1,3-bisphosphoglycerate fil-glikolisi39. Filwaqt li studji preċedenti ffokaw fuq ir-rwol tal-kataboliżmu tat-triptofan fir-regolazzjoni immuni, fittixna li niċċaraw l-interazzjoni bejn id-disregolazzjoni tat-triptofan u l-mogħdijiet glikolitiċi osservati fl-istudju attwali. Il-membru 5 tal-familja tat-trasportaturi tas-soluti 7 (SLC7A5) huwa magħruf li huwa trasportatur tat-triptofan43,44,45. Il-fosforibosiltransferażi tal-aċidu kinoliniku (QPRT) hija enzima li tinsab 'l isfel mill-mogħdija tal-kynurenine li tikkonverti l-aċidu kinoliniku għal NAMN46. L-ispezzjoni tad-dataset LUAD TCGA żvelat li kemm SLC7A5 kif ukoll QPRT kienu regolati 'l fuq b'mod sinifikanti fit-tessut tat-tumur meta mqabbla mat-tessut normali (Fig. 5e). Din iż-żieda ġiet osservata fl-istadji I u II kif ukoll fl-istadji III u IV tal-adenokarċinoma tal-pulmun (Figura Supplimentari 11), li tindika disturbi bikrija fil-metaboliżmu tat-triptofan assoċjati mat-tumoriġenesi.
Barra minn hekk, id-dataset LUAD-TCGA wera korrelazzjoni pożittiva bejn l-espressjoni tal-mRNA ta' SLC7A5 u GAPDH f'kampjuni ta' pazjenti bil-kanċer (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figura 5f). B'kuntrast, ma nstabet l-ebda korrelazzjoni sinifikanti bejn firem tal-ġeni bħal dawn fit-tessut normali tal-pulmun (r = 0.25, p = 0.06, Figura 5f). It-tnaqqis ta' SLC7A5 (Figura Supplimentari 12) fiċ-ċelloli A549 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ċellulari ta' triptofan u NAD(H) (Figura 5g,h), li rriżulta f'attività glikolitika attenwata kif imkejla bir-rata ta' aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR) (Figura 1). 5i). Għalhekk, abbażi tal-bidliet metaboliċi fis-serum u d-detezzjoni in vitro, aħna nissoponu li l-metaboliżmu tat-triptofan jista' jipproduċi NAD+ permezz tal-mogħdija tal-kynurenine u għandu rwol importanti fil-promozzjoni tal-glikoliżi fil-kanċer tal-pulmun.
Studji wrew li numru kbir ta’ noduli pulmonari indeterminati skoperti permezz ta’ LDCT jista’ jwassal għall-ħtieġa għal testijiet addizzjonali bħal PET-CT, bijopsija tal-pulmun, u trattament żejjed minħabba dijanjosi falza-pożittiva ta’ malignità.31 Kif muri fil-Figura 6, l-istudju tagħna identifika panel ta’ metaboliti fis-serum b’valur dijanjostiku potenzjali li jista’ jtejjeb l-istratifikazzjoni tar-riskju u l-immaniġġjar sussegwenti tan-noduli pulmonari skoperti permezz ta’ CT.
In-noduli pulmonari huma evalwati bl-użu ta' tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa (LDCT) b'karatteristiċi tal-immaġini li jissuġġerixxu kawżi beninni jew malinni. L-eżitu inċert tan-noduli jista' jwassal għal żjarat ta' segwitu frekwenti, interventi bla bżonn, u trattament żejjed. L-inklużjoni ta' klassifikaturi metaboliċi tas-serum b'valur dijanjostiku tista' ttejjeb il-valutazzjoni tar-riskju u l-immaniġġjar sussegwenti tan-noduli pulmonari. Tomografija tal-emissjoni tal-pożitroni PET.
Dejta mill-istudju NLST tal-Istati Uniti u l-istudju NELSON Ewropew tissuġġerixxi li l-iskrinjar ta' gruppi ta' riskju għoli b'tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa (LDCT) jista' jnaqqas il-mortalità mill-kanċer tal-pulmun1,3. Madankollu, il-valutazzjoni tar-riskju u l-immaniġġjar kliniku sussegwenti ta' għadd kbir ta' noduli pulmonari inċidentali skoperti permezz ta' LDCT jibqgħu l-aktar ta' sfida. L-għan ewlieni huwa li tiġi ottimizzata l-klassifikazzjoni korretta tal-protokolli eżistenti bbażati fuq LDCT billi jiġu inkorporati bijomarkaturi affidabbli.
Ċerti bijomarkaturi molekulari, bħal metaboliti fid-demm, ġew identifikati billi tqabbel il-kanċer tal-pulmun ma' kontrolli b'saħħithom15,17. Fl-istudju attwali, iffukajna fuq l-applikazzjoni tal-analiżi metabolomika tas-serum biex niddistingwu bejn noduli pulmonari beninni u malinni skoperti inċidentalment permezz ta' LDCT. Qabbilna l-metaboloma globali tas-serum ta' kontroll b'saħħtu (HC), noduli beninni tal-pulmun (BN), u kampjuni ta' adenokarċinoma tal-pulmun (LA) fl-istadju I bl-użu tal-analiżi UPLC-HRMS. Sibna li HC u BN kellhom profili metaboliċi simili, filwaqt li LA wera bidliet sinifikanti meta mqabbel ma' HC u BN. Identifikajna żewġ settijiet ta' metaboliti tas-serum li jiddistingwu LA minn HC u BN.
L-iskema attwali ta' identifikazzjoni bbażata fuq l-LDCT għal noduli beninni u malinni hija prinċipalment ibbażata fuq id-daqs, id-densità, il-morfoloġija u r-rata ta' tkabbir tan-noduli maż-żmien30. Studji preċedenti wrew li d-daqs tan-noduli huwa relatat mill-qrib mal-probabbiltà ta' kanċer tal-pulmun. Anke f'pazjenti b'riskju għoli, ir-riskju ta' malignità fin-noduli <6 mm huwa <1%. Ir-riskju ta' malignità għal noduli li jkejlu minn 6 sa 20 mm ivarja minn 8% sa 64%30. Għalhekk, is-Soċjetà Fleischner tirrakkomanda dijametru ta' qtugħ ta' 6 mm għal segwitu ta' rutina bis-CT.29 Madankollu, il-valutazzjoni tar-riskju u l-immaniġġjar ta' noduli pulmonari indeterminati (IPN) akbar minn 6 mm ma twettqux b'mod adegwat31. L-immaniġġjar attwali tal-mard konġenitali tal-qalb ġeneralment huwa bbażat fuq stennija attenta b'monitoraġġ frekwenti bis-CT.
Abbażi tal-metaboloma vvalidata, wrejna għall-ewwel darba s-sovrappożizzjoni tal-firem metabolomiċi bejn individwi b'saħħithom u noduli beninni <6 mm. Ix-xebh bijoloġiku huwa konsistenti mas-sejbiet preċedenti tas-CT li r-riskju ta' malignità għal noduli <6 mm huwa baxx daqs għal suġġetti mingħajr noduli.30 Ta' min jinnota li r-riżultati tagħna juru wkoll li noduli beninni <6 mm u ≥6 mm għandhom xebh għoli fil-profili metabolomiċi, li jissuġġerixxi li d-definizzjoni funzjonali tal-etjoloġija beninna hija konsistenti irrispettivament mid-daqs tan-noduli. Għalhekk, il-pannelli moderni tal-metaboliti tas-serum dijanjostiċi jistgħu jipprovdu assay wieħed bħala test ta' esklużjoni meta n-noduli jiġu skoperti inizjalment fuq is-CT u potenzjalment inaqqsu l-monitoraġġ serjali. Fl-istess ħin, l-istess panel ta' bijomarkaturi metaboliċi ddistingwa noduli malinni ≥6 mm fid-daqs minn noduli beninni u pprovda tbassir preċiż għal IPNs ta' daqs simili u karatteristiċi morfoloġiċi ambigwi fuq immaġini tas-CT. Dan il-klassifikatur tal-metaboliżmu tas-serum ħadem tajjeb fit-tbassir tal-malignità ta' noduli ≥6 mm b'AUC ta' 0.927. Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jindikaw li l-firem metabolomiċi uniċi tas-serum jistgħu jirriflettu speċifikament bidliet metaboliċi bikrija kkaġunati mit-tumur u għandhom valur potenzjali bħala preditturi tar-riskju, indipendentement mid-daqs tan-noduli.
Ta' min jinnota li l-adenokarċinoma tal-pulmun (LUAD) u l-karċinoma taċ-ċelluli skwamużi (LUSC) huma t-tipi ewlenin ta' kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC). Minħabba li l-LUSC huwa assoċjat b'mod qawwi mal-użu tat-tabakk47 u l-LUAD huwa l-aktar istoloġija komuni ta' noduli inċidentali tal-pulmun skoperti fuq skrinjar tas-CT48, il-mudell tal-klassifikatur tagħna nbena speċifikament għal kampjuni ta' adenokarċinoma fl-istadju I. Wang u l-kollegi tiegħu ffokaw ukoll fuq il-LUAD u identifikaw disa' firem lipidiċi bl-użu tal-lipidomika biex jiddistingwu l-kanċer tal-pulmun fl-istadju bikri minn individwi b'saħħithom17. Ittestjajna l-mudell tal-klassifikatur attwali fuq 16-il każ ta' LUSC fl-istadju I u 74 nodulu beninni u osservajna preċiżjoni baxxa fit-tbassir tal-LUSC (AUC 0.776), li tissuġġerixxi li l-LUAD u l-LUSC jista' jkollhom il-firem metabolomiċi tagħhom stess. Tabilħaqq, intwera li l-LUAD u l-LUSC huma differenti fl-etjoloġija, l-oriġini bijoloġika u l-aberrazzjonijiet ġenetiċi49. Għalhekk, tipi oħra ta' istoloġija għandhom jiġu inklużi fil-mudelli ta' taħriġ għall-iskoperta tal-kanċer tal-pulmun ibbażata fuq il-popolazzjoni fi programmi ta' skrinjar.
Hawnhekk, identifikajna s-sitt mogħdijiet l-aktar mibdula ta' spiss fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom u noduli beninni. Xanthine u hypoxanthine huma metaboliti komuni tal-mogħdija metabolika tal-purina. Konsistenti mar-riżultati tagħna, l-intermedjati assoċjati mal-metaboliżmu tal-purina żdiedu b'mod sinifikanti fis-serum jew fit-tessuti ta' pazjenti b'adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom jew pazjenti fl-istadju preinvażiv15,50. Livelli elevati ta' xanthine u hypoxanthine fis-serum jistgħu jirriflettu l-anaboliżmu meħtieġ minn ċelloli tal-kanċer li jipproliferaw malajr. Id-disregolazzjoni tal-metaboliżmu tal-glukożju hija karatteristika magħrufa sew tal-metaboliżmu tal-kanċer51. Hawnhekk, osservajna żieda sinifikanti fil-piruvat u l-lattat fil-grupp LA meta mqabbel mal-grupp HC u BN, li huwa konsistenti ma' rapporti preċedenti ta' anormalitajiet fil-mogħdija glikolitika fil-profili tal-metabolomi tas-serum ta' pazjenti b'kanċer tal-pulmun mhux taċ-ċelluli żgħar (NSCLC) u kontrolli b'saħħithom. Ir-riżultati huma konsistenti52,53.
Importanti, osservajna korrelazzjoni inversa bejn il-metaboliżmu tal-piruvat u t-triptofan fis-serum tal-adenokarċinomi tal-pulmun. Il-livelli tat-triptofan fis-serum tnaqqsu fil-grupp LA meta mqabbla mal-grupp HC jew BN. Interessanti, studju preċedenti fuq skala kbira li uża koorti prospettiva sab li livelli baxxi ta’ triptofan fiċ-ċirkolazzjoni kienu assoċjati ma’ riskju akbar ta’ kanċer tal-pulmun 54. It-triptofan huwa aċidu amminiku essenzjali li niksbu kompletament mill-ikel. Nikkonkludu li t-tnaqqis tat-triptofan fis-serum fl-adenokarċinoma tal-pulmun jista’ jirrifletti tnaqqis rapidu ta’ dan il-metabolit. Huwa magħruf sew li l-prodott finali tal-kataboliżmu tat-triptofan permezz tal-mogħdija tal-kynurenine huwa s-sors tas-sintesi de novo NAD+. Minħabba li NAD+ huwa prodott primarjament permezz tal-mogħdija tas-salvataġġ, l-importanza ta’ NAD+ fil-metaboliżmu tat-triptofan fis-saħħa u l-mard għad trid tiġi determinata46. L-analiżi tagħna tad-database tat-TCGA wriet li l-espressjoni tat-trasportatur tas-solut tat-triptofan 7A5 (SLC7A5) żdiedet b'mod sinifikanti fl-adenokarċinoma tal-pulmun meta mqabbla ma' kontrolli normali u kienet korrelata b'mod pożittiv mal-espressjoni tal-enzima glikolitika GAPDH. Studji preċedenti ffokaw prinċipalment fuq ir-rwol tal-kataboliżmu tat-triptofan fis-soppressjoni tar-rispons immuni kontra t-tumur40,41,42. Hawnhekk nuru li l-inibizzjoni tal-assorbiment tat-triptofan permezz tat-tnaqqis ta' SLC7A5 fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-pulmun tirriżulta fi tnaqqis sussegwenti fil-livelli ċellulari ta' NAD u attenwazzjoni konkomitanti tal-attività glikolitika. Fil-qosor, l-istudju tagħna jipprovdi bażi bijoloġika għal bidliet fil-metaboliżmu tas-serum assoċjati mat-trasformazzjoni malinna tal-adenokarċinoma tal-pulmun.
Il-mutazzjonijiet tal-EGFR huma l-aktar mutazzjonijiet komuni li jwasslu f'pazjenti b'NSCLC. Fl-istudju tagħna, sibna li pazjenti b'mutazzjoni tal-EGFR (n = 41) kellhom profili metabolomiċi ġenerali simili għal pazjenti b'EGFR tat-tip selvaġġ (n = 31), għalkemm sibna livelli mnaqqsa fis-serum ta' xi pazjenti b'mutanti tal-EGFR f'pazjenti b'acylcarnitine. Il-funzjoni stabbilita tal-acylcarnitines hija li jittrasportaw gruppi acyl miċ-ċitoplasma fil-matriċi mitokondrijali, li twassal għall-ossidazzjoni tal-aċidi grassi biex jipproduċu l-enerġija 55. Konsistenti mas-sejbiet tagħna, studju reċenti identifika wkoll profili metabolomiċi simili bejn tumuri mutanti tal-EGFR u tumuri tat-tip selvaġġ tal-EGFR billi analizza l-metaboloma globali ta' 102 kampjuni ta' tessut ta' adenokarċinoma tal-pulmun 50. Interessanti, il-kontenut ta' acylcarnitine nstab ukoll fil-grupp mutanti tal-EGFR. Għalhekk, jekk il-bidliet fil-livelli ta' acylcarnitine jirriflettux bidliet metaboliċi kkaġunati mill-EGFR u l-mogħdijiet molekulari sottostanti jistgħu jistħoqqilhom aktar studju.
Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna jistabbilixxi klassifikatur metaboliku tas-serum għad-dijanjosi differenzjali tan-noduli pulmonari u jipproponi fluss tax-xogħol li jista' jottimizza l-valutazzjoni tar-riskju u jiffaċilita l-ġestjoni klinika bbażata fuq l-iskrinjar tas-CT scan.
Dan l-istudju ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Isptar tal-Kanċer tal-Università ta' Sun Yat-sen, l-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università ta' Sun Yat-sen, u l-Kumitat tal-Etika tal-Isptar tal-Kanċer tal-Università ta' Zhengzhou. Fil-gruppi ta' skoperta u validazzjoni interna, inġabru 174 serum minn individwi b'saħħithom u 244 serum minn noduli beninni minn individwi li kienu qed jagħmlu eżamijiet mediċi annwali fid-Dipartiment tal-Kontroll u l-Prevenzjoni tal-Kanċer, iċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università ta' Sun Yat-sen, u 166 noduli beninni serum. Adenokarċinomi tal-pulmun tal-Istadju I inġabru miċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università ta' Sun Yat-sen. Fil-koorti ta' validazzjoni esterna, kien hemm 48 każ ta' noduli beninni, 39 każ ta' adenokarċinoma tal-pulmun tal-istadju I mill-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università ta' Sun Yat-sen, u 24 każ ta' adenokarċinoma tal-pulmun tal-istadju I mill-Isptar tal-Kanċer ta' Zhengzhou. Iċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università Sun Yat-sen ġabar ukoll 16-il każ ta’ kanċer tal-pulmun taċ-ċelluli skwamużi tal-istadju I biex jittestja l-abbiltà dijanjostika tal-klassifikatur metaboliku stabbilit (il-karatteristiċi tal-pazjent huma murija fit-Tabella Supplimentari 5). Kampjuni mill-koorti ta’ skoperta u l-koorti ta’ validazzjoni interna nġabru bejn Jannar 2018 u Mejju 2020. Kampjuni għall-koorti ta’ validazzjoni esterna nġabru bejn Awwissu 2021 u Ottubru 2022. Biex jiġi minimizzat il-preġudizzju bejn is-sessi, numru bejn wieħed u ieħor ugwali ta’ każijiet irġiel u nisa ġew assenjati lil kull koorti. Tim ta’ Skoperta u Tim ta’ Reviżjoni Interna. Is-sess tal-parteċipant ġie determinat abbażi ta’ awtorapport. Inkiseb kunsens infurmat mill-parteċipanti kollha u ma ngħata l-ebda kumpens. Is-suġġetti b’noduli beninni kienu dawk bi punteġġ stabbli ta’ CT scan wara sentejn sa ħames snin fil-ħin tal-analiżi, ħlief għal każ wieħed mill-kampjun ta’ validazzjoni esterna, li nġabar qabel l-operazzjoni u ġie djanjostikat permezz ta’ istopatoloġija. Bl-eċċezzjoni tal-bronkite kronika. Każijiet ta’ adenokarċinoma tal-pulmun inġabru qabel ir-resezzjoni tal-pulmun u ġew ikkonfermati permezz ta’ dijanjosi patoloġika. Kampjuni tad-demm waqt is-sawm inġabru f’tubi ta’ separazzjoni tas-serum mingħajr ebda antikoagulant. Kampjuni tad-demm ġew magħqudin għal siegħa f'temperatura tal-kamra u mbagħad iċċentrifugati b'2851 × g għal 10 minuti f'4°C biex jinġabar is-supernatant tas-serum. L-alikwoti tas-serum ġew iffriżati f'-80°C sakemm ġie estratt il-metabolit. Id-Dipartiment tal-Prevenzjoni tal-Kanċer u l-Eżami Mediku taċ-Ċentru tal-Kanċer tal-Università Sun Yat-sen ġabar ġabra ta' serum minn 100 donatur b'saħħtu, inkluż numru ugwali ta' rġiel u nisa ta' bejn 40 u 55 sena. Volumi ugwali ta' kull kampjun ta' donatur ġew imħallta, il-ġabra li rriżultat ġiet alikwotata u maħżuna f'-80°C. It-taħlita tas-serum intużat bħala materjal ta' referenza għall-kontroll tal-kwalità u l-istandardizzazzjoni tad-dejta.
Is-serum ta' referenza u l-kampjuni tat-test ġew imdewba u l-metaboliti ġew estratti bl-użu ta' metodu ta' estrazzjoni kkombinat (MTBE/metanol/ilma) 56. Fil-qosor, 50 μl ta' serum tħalltu ma' 225 μl ta' metanol kiesaħ silġ u 750 μl ta' metil tert-butyl ether (MTBE) kiesaħ silġ. Ħawwad it-taħlita u inkubaha fuq is-silġ għal siegħa. Il-kampjuni mbagħad tħalltu u ġew imħallta b'vortex ma' 188 μl ta' ilma ta' grad MS li fih standards interni (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, u 13C6-isoleucine, mixtrija minn Cambridge Isotope Laboratories). It-taħlita mbagħad ġiet ċentrifugata b'15,000 × g għal 10 minuti f'4 °C, u l-fażi t'isfel ġiet trasferita f'żewġ tubi (125 μL kull wieħed) għall-analiżi LC-MS fil-modi pożittivi u negattivi. Fl-aħħar, il-kampjun ġie evaporat sakemm jinxef f'konċentratur tal-vakwu b'veloċità għolja.
Il-metaboliti mnixxfa ġew rikostitwiti f'120 μl ta' 80% aċetonitrile, imħawwra bil-vortex għal 5 minuti, u ċċentrifugata b'15,000 × g għal 10 minuti f'4°C. Is-supernatanti ġew trasferiti fi kunjetti tal-ħġieġ ambra b'mikroinserzjonijiet għal studji metabolomiċi. Analiżi metabolomika mhux immirata fuq pjattaforma ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-kbira-spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (UPLC-HRMS). Il-metaboliti ġew separati bl-użu ta' sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC u kolonna ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Fil-modalità ta' jonju pożittiv, il-fażijiet mobbli kienu 95% (A) u 50% aċetonitrile (B), kull waħda fiha 10 mmol/L ammonju aċetat u 0.1% aċidu formiku. Fil-modalità negattiva, il-fażijiet mobbli A u B kien fihom 95% u 50% aċetonitrile, rispettivament, iż-żewġ fażijiet kien fihom 10 mmol/L aċetat tal-ammonju, pH = 9. Il-programm tal-gradjent kien kif ġej: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98–2% B; 16.1–20 min, 2% B. Il-kolonna nżammet f'40°C u l-kampjun f'10°C fl-awtosampler. Ir-rata tal-fluss kienet ta' 0.3 ml/min, il-volum tal-injezzjoni kien ta' 3 μl. Spettrometru tal-massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) b'sors ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej (ESI) tħaddem fil-modalità ta' skennjar sħiħ u akkoppjat mal-modalità ta' monitoraġġ ddMS2 biex jiġbor volumi kbar ta' dejta. Il-parametri tal-MS ġew issettjati kif ġej: vultaġġ tal-isprej +3.8 kV/- 3.2 kV, temperatura kapillari 320°C, gass protettiv 40 arb, gass awżiljarju 10 arb, temperatura tal-ħiter tas-sonda 350°C, firxa ta' skennjar 70–1050 m/h, riżoluzzjoni. 70 000. Id-dejta nkisbet bl-użu ta' Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Biex tiġi vvalutata l-kwalità tad-dejta, ġew iġġenerati kampjuni miġbura ta' kontroll tal-kwalità (QC) billi tneħħew alikwoti ta' 10 μL tas-supernatant minn kull kampjun. Sitt injezzjonijiet ta' kampjuni ta' kontroll tal-kwalità ġew analizzati fil-bidu tas-sekwenza analitika biex tiġi vvalutata l-istabbiltà tas-sistema UPLC-MS. Il-kampjuni ta' kontroll tal-kwalità mbagħad jiġu introdotti perjodikament fil-lott. Il-11-il lott kollha ta' kampjuni tas-serum f'dan l-istudju ġew analizzati permezz ta' LC-MS. Alikwoti ta' taħlita ta' ġabra ta' serum minn 100 donatur b'saħħtu ntużaw bħala materjal ta' referenza f'lottijiet rispettivi biex jiġi mmonitorjat il-proċess ta' estrazzjoni u jiġi aġġustat għall-effetti minn lott għal lott. Analiżi metabolomika mhux immirata tal-koorti ta' skoperta, il-koorti ta' validazzjoni interna, u l-koorti ta' validazzjoni esterna twettqet fiċ-Ċentru tal-Metabolomika tal-Università Sun Yat-sen. Il-laboratorju estern taċ-Ċentru tal-Analiżi u l-Ittestjar tal-Università tat-Teknoloġija ta' Guangdong analizza wkoll 40 kampjun mill-koorti esterna biex jittestja l-prestazzjoni tal-mudell tal-klassifikatur.
Wara l-estrazzjoni u r-rikostituzzjoni, il-kwantifikazzjoni assoluta tal-metaboliti fis-serum ġiet imkejla bl-użu ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja-spettrometrija tal-massa tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) b'sors ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej (ESI) f'modalità ta' monitoraġġ ta' reazzjoni multipla (MRM). Kolonna ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) intużat biex tissepara l-metaboliti. Il-fażi mobbli kienet tikkonsisti minn 90% (A) u 5% aċetonitrile (B) b'10 mmol/L ammonju aċetat u soluzzjoni ta' 0.1% ammonja. Il-programm tal-gradjent kien kif ġej: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Il-kolonna nżammet f'40 °C u l-kampjun f'10 °C fl-awtosampler. Ir-rata tal-fluss kienet ta' 0.3 mL/min u l-volum tal-injezzjoni kien ta' 1 μL. Il-parametri tal-MS ġew issettjati kif ġej: vultaġġ kapillari ±3.5 kV, pressjoni tan-nebulizzatur 35 psi, fluss tal-gass tal-kisi 12 L/min, temperatura tal-gass tal-kisi 350°C, temperatura tal-gass tat-tnixxif 250°C, u fluss tal-gass tat-tnixxif 14 l/min. Il-konverżjonijiet MRM ta' tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine u xanthine kienu 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 u 151.0–107.9 rispettivament. Id-dejta nġabret bl-użu ta' Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Għal kampjuni tas-serum, it-triptofan, il-piruvat, il-lattat, l-ipoksantina, u l-ksantina ġew kwantifikati bl-użu ta' kurvi ta' kalibrazzjoni ta' soluzzjonijiet ta' taħlita standard. Għal kampjuni taċ-ċelluli, il-kontenut tat-triptofan ġie normalizzat għall-istandard intern u l-massa tal-proteina taċ-ċelluli.
L-estrazzjoni tal-quċċata (m/z u l-ħin ta' żamma (RT)) twettqet bl-użu ta' Compound Discovery 3.1 u TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Biex jiġu eliminati d-differenzi potenzjali bejn il-lottijiet, kull quċċata karatteristika tal-kampjun tat-test ġiet diviża bil-quċċata karatteristika tal-materjal ta' referenza mill-istess lott biex tinkiseb l-abbundanza relattiva. Id-devjazzjonijiet standard relattivi tal-istandards interni qabel u wara l-istandardizzazzjoni huma murija fit-Tabella Supplimentari 6. Id-differenzi bejn iż-żewġ gruppi kienu kkaratterizzati minn rata ta' skoperta falza (FDR<0.05, test tal-grad iffirmat ta' Wilcoxon) u bidla fil-ħin (>1.2 jew <0.83). Id-dejta MS mhux ipproċessata tal-karatteristiċi estratti u d-dejta MS ikkoreġuta bis-serum ta' referenza huma murija fid-Dejta Supplimentari 1 u d-Dejta Supplimentari 2, rispettivament. L-annotazzjoni tal-quċċata twettqet abbażi ta' erba' livelli definiti ta' identifikazzjoni, inklużi metaboliti identifikati, komposti annotati b'mod putattiv, klassijiet ta' komposti kkaratterizzati b'mod putattiv, u komposti mhux magħrufa 22. Abbażi ta' tfittxijiet fid-database f'Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), komposti bijoloġiċi bi standards validati li jaqblu mal-MS/MS jew annotazzjonijiet ta' tqabbil eżatt f'mzCloud (punteġġ > 85) jew Chemspider intgħażlu finalment bħala intermedji bejn il-metaboloma differenzjali. L-annotazzjonijiet tal-quċċata għal kull karatteristika huma inklużi fid-Data Supplimentari 3. MetaboAnalyst 5.0 intuża għal analiżi univarjata tal-abbundanza tal-metaboliti normalizzati għas-somma. MetaboAnalyst 5.0 evalwa wkoll l-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija KEGG ibbażata fuq metaboliti sinifikament differenti. L-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) u l-analiżi diskriminanti tal-inqas kwadri parzjali (PLS-DA) ġew analizzati bl-użu tal-pakkett tas-softwer ropls (v.1.26.4) bin-normalizzazzjoni tal-munzell u l-awtoskaling. Il-mudell ottimali tal-bijomarkatur tal-metabolit għat-tbassir tal-malinnità tan-noduli ġie ġġenerat bl-użu ta' rigressjoni loġistika binarja bl-inqas tnaqqis assolut u operatur tal-għażla (LASSO, pakkett R v.4.1-3). Il-prestazzjoni tal-mudell diskriminanti fis-settijiet ta' skoperta u validazzjoni ġiet ikkaratterizzata billi ġiet stmata l-AUC ibbażata fuq l-analiżi ROC skont il-pakkett pROC (v.1.18.0.). Il-limitu ottimali tal-probabbiltà nkiseb abbażi tal-indiċi massimu ta' Youden tal-mudell (sensittività + speċifiċità – 1). Kampjuni b'valuri inqas jew akbar mil-limitu se jiġu mbassra bħala noduli beninni u adenokarċinoma tal-pulmun, rispettivament.
Ċelloli A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ġew imkabbra f'mezz F-12K li fih 10% FBS. Sekwenzi ta' RNA short hairpin (shRNA) li jimmiraw lejn SLC7A5 u kontroll mhux immirat (NC) ġew imdaħħla fil-vettur lentivirali pLKO.1-puro. Is-sekwenzi antisens ta' shSLC7A5 huma kif ġej: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikorpi għal SLC7A5 (#5347) u tubulina (#2148) inxtraw minn Cell Signaling Technology. Antikorpi għal SLC7A5 u tubulina ntużaw f'dilwizzjoni ta' 1:1000 għall-analiżi tal-Western blot.
It-Test tal-Istress Glikolitiku Seahorse XF ikejjel il-livelli ta' aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR). Fl-assaġġ, il-glukożju, l-oligomycin A, u 2-DG ingħataw sekwenzjalment biex tiġi ttestjata l-kapaċità glikolitika ċellulari kif imkejla mill-ECAR.
Ċelloli A549 trasfettati b'kontroll mhux immirat (NC) u shSLC7A5 (Sh1, Sh2) tqiegħdu matul il-lejl fi platti b'dijametru ta' 10 ċm. Il-metaboliti taċ-ċelloli ġew estratti b'1 ml ta' metanol akweju ta' 80% kiesaħ silġ. Iċ-ċelloli fis-soluzzjoni tal-metanol tneħħew, inġabru f'tubu ġdid, u ġew ċentrifugati b'15,000 × g għal 15-il minuta f'4°C. Iġbor 800 µl ta' supernatant u nixxef bl-użu ta' konċentratur tal-vakwu b'veloċità għolja. Il-gerbub tal-metaboliti mnixxfa mbagħad ġew analizzati għal-livelli ta' triptofan bl-użu ta' LC-MS/MS kif deskritt hawn fuq. Il-livelli ċellulari ta' NAD(H) fiċ-ċelloli A549 (NC u shSLC7A5) tkejlu bl-użu ta' kit kolorimetriku kwantitattiv NAD+/NADH (#K337, BioVision) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-livelli ta' proteini tkejlu għal kull kampjun biex jiġi normalizzat l-ammont ta' metaboliti.
Ma ntużaw l-ebda metodi statistiċi biex jiġi ddeterminat b'mod preliminari d-daqs tal-kampjun. Studji metabolomiċi preċedenti mmirati lejn l-iskoperta ta' bijomarkaturi15,18 ġew ikkunsidrati bħala parametri referenzjarji għad-determinazzjoni tad-daqs, u meta mqabbla ma' dawn ir-rapporti, il-kampjun tagħna kien adegwat. L-ebda kampjun ma ġie eskluż mill-koorti tal-istudju. Il-kampjuni tas-serum ġew assenjati b'mod każwali lil grupp ta' skoperta (306 każijiet, 74.6%) u grupp ta' validazzjoni interna (104 każijiet, 25.4%) għal studji metabolomiċi mhux immirati. Għażilna wkoll b'mod każwali 70 każ minn kull grupp mis-sett ta' skoperta għal studji metabolomiċi mmirati. L-investigaturi ma kinux jafu bl-assenjazzjoni tal-grupp waqt il-ġbir u l-analiżi tad-dejta LC-MS. L-analiżijiet statistiċi tad-dejta metabolomiċi u l-esperimenti taċ-ċelluli huma deskritti fit-taqsimiet rispettivi tar-Riżultati, il-Leġġendi tal-Figuri, u l-Metodi. Il-kwantifikazzjoni tat-triptofan ċellulari, in-NADT, u l-attività glikolitika twettqet tliet darbiet b'mod indipendenti b'riżultati identiċi.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-Astratt tar-Rapport tal-Portafoll Naturali assoċjat ma' dan l-artiklu.
Id-dejta MS mhux ipproċessata tal-karatteristiċi estratti u d-dejta MS normalizzata tas-serum ta' referenza huma murija fid-Dejta Supplimentari 1 u d-Dejta Supplimentari 2, rispettivament. L-annotazzjonijiet tal-quċċata għall-karatteristiċi differenzjali huma ppreżentati fid-Dejta Supplimentari 3. Is-sett tad-dejta LUAD TCGA jista' jitniżżel minn https://portal.gdc.cancer.gov/. Id-dejta tal-input għat-tfassil tal-graff hija pprovduta fid-dejta tas-sors. Id-dejta tas-sors hija pprovduta għal dan l-artikolu.
Grupp ta' Studju Nazzjonali dwar l-Iskrining tal-Pulmun, eċċ. Tnaqqis tal-mortalità mill-kanċer tal-pulmun b'tomografija kompjuterizzata b'doża baxxa. Ingilterra ta' Fuq. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR u Prophet, PC Skrining tal-kanċer tal-pulmun bl-użu ta' CT spirali b'doża baxxa: riżultati mill-Istudju Nazzjonali tal-Iskrining tal-Pulmun (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Tnaqqis tal-mortalità mill-kanċer tal-pulmun permezz ta' skrinjar volumetriku tas-CT fi prova każwali. Ingilterra tat-Tramuntana. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Ħin tal-posta: 18 ta' Settembru 2023